[γ³²P]ATP激酶標(biāo)記法PCR產(chǎn)物處理試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 [γ³²P]ATP激酶標(biāo)記法PCR產(chǎn)物處理試劑是一種旨在通過同位素標(biāo)記PCR反應(yīng)產(chǎn)物，作為探針用于探測核酸－蛋白結(jié)合的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于后續(xù)足跡法分析、EMSA、南方雜交等實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，足跡清晰，重復(fù)性好。

 

技術(shù)背景

 

DNA和蛋白質(zhì)的相互作用是調(diào)控細(xì)胞反應(yīng)過程的要素之一。其中DNA酶足跡法技術(shù)（DNase I Footprinting Assay）是一項(xiàng)確定DNA和蛋白質(zhì)相互作用，例如激素受體復(fù)合物與激素反應(yīng)元素的結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子與操縱子（operator）、增強(qiáng)子（enhancer）和沉默子（silencer）的結(jié)合等，分析基因調(diào)控，定性或定位檢測特定蛋白的DNA結(jié)合序列的主要分析技術(shù)之一。首先，目標(biāo)DNA克隆或擴(kuò)增分離純化出來，進(jìn)行單鏈單末端同位素標(biāo)記，然后與目標(biāo)蛋白進(jìn)行體外結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)而使用DNA酶I隨機(jī)切離，產(chǎn)生一系列不同長度的DNA片段，其中結(jié)合部位的DNA由于空間位阻等多種效應(yīng)，無法降解（DNA酶保護(hù)作用），在變性丙烯酰胺凝膠電泳圖譜上，出現(xiàn)條帶強(qiáng)度的減弱或缺失，形成“足跡”。進(jìn)而對未經(jīng)結(jié)合反應(yīng)的同一區(qū)域條帶進(jìn)行測序，獲得特定蛋白質(zhì)所結(jié)合的核苷酸序列。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

酶標(biāo)液（Reagent A） 100微升

補(bǔ)充液（Reagent B）        1毫升

反應(yīng)液（Reagent C）      600微升

萃取液（Reagent D）    6毫升

濃縮液（Reagent E）    2毫升

助沉液（Reagent F）  20微升

沉淀液（Reagent G）  20毫升

凈化液（Reagent H）  20毫升

保存液（Reagent I）   1毫升

產(chǎn)品說明書       1份

 

保存方式

 

保存酶標(biāo)液（Reagent A）、反應(yīng)液（Reagent C）、萃取液（Reagent D）和助沉液（Reagent F）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

寡核苷酸引物探針：用于擴(kuò)增目標(biāo)DNA分子

同位素γATP³²P：用于標(biāo)記探針

0.5毫升PCR管：用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)操作的容器

1.5毫升離心管：用于反應(yīng)操作的容器

干式恒溫儀或恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

微型臺式離心機(jī)：用于樣品操作

PCR儀：用于擴(kuò)增反應(yīng)

聚丙烯酰胺凝膠：用于產(chǎn)物電泳分離

電泳儀：用于電泳操作的儀器

放射性測讀儀：用于同位素放射性定量

 

實(shí)驗(yàn)步驟

  

• 引物標(biāo)記

 

• 開啟37℃和70℃干式恒溫儀
• 準(zhǔn)備1個1.5毫升離心管
• 按照下表依次加入反應(yīng)物

 

內(nèi)容物	反應(yīng)用量
酶標(biāo)液（Reagent A）	5微升
用戶自備的上游引物	1微升（總量350納克）
同位素γATP32P	1微升（150微居里）
補(bǔ)充液（Reagent B）	總量至10微升

 

• 分別渦旋震蕩3秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)瞬時離心
• 放進(jìn)37℃干式恒溫儀，孵育1小時
• 放進(jìn)70℃干式恒溫儀，孵育10分鐘
• 放進(jìn)－20℃冰箱里備用

 

• 擴(kuò)增反應(yīng)

 

• 準(zhǔn)備1個0.5毫升PCR管，置于冰槽里
• 按照下表依次加入反應(yīng)物

內(nèi)容物	樣品管
反應(yīng)液（Reagent C）	30微升
同位素標(biāo)記的上游引物	10微升
未標(biāo)記的下游引物	1微升（總量350納克）
模板DNA	1微升（總量100納克）
補(bǔ)充液（Reagent B）	8微升
總量	50微升

 

• 混勻
• 即刻放進(jìn)PCR儀，按照下表擴(kuò)增

 

反應(yīng)溫度（℃）	反應(yīng)時間	反應(yīng)循環(huán)
94	2分鐘	1
94	30秒	30
Tm	30秒
72	30秒
72	5分鐘	1

 

三、膠純化

 

• 準(zhǔn)備一個10％聚丙烯酰胺（19：1）凝膠（建議1.5mm厚，10條泳道，垂直電泳）
• 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳
• 切離目標(biāo)條帶
• 洗脫DNA（容量為300微升）（注意：建議使用聚丙烯酰胺凝膠粉碎法膠回收試劑盒-20008.1）
• 加入300微升萃取液（Reagent D）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管
• 加入100微升濃縮液（Reagent E）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent F）
• 加入800微升沉淀液（Reagent G）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000 RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標(biāo)記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent H）
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000 RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 定量沉淀顆粒的放射性
• 加入適量的保存液（Reagent I）（50000 CPM/微升），溶解顆粒群
• 放進(jìn)4℃冰箱里保存（注意：不宜超過1周）

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 同位素操須嚴(yán)格遵守規(guī)章制度
• 同位素γATP³²P，建議使用AMERSHAN（安瑪西亞）公司
• 建議使用新鮮同位素材料
• 建議探針標(biāo)記后即刻使用
• 通常PCR產(chǎn)物標(biāo)記為100至500堿基，小于200堿基為佳
• 電泳前注意清洗樣品孔
• 電泳建議在4℃環(huán)境下進(jìn)行，注意安全
• 本公司提供系列蛋白研究產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯影清晰

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