適配體（ADAPTER）連接試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

適配體（ADAPTER）連接試劑是一種旨在針對目標適配體、線性載體和片段DNA的系列末端處理，高效連接和亞克隆，便于進一步菌化的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種適配體DNA分子的裝配。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，反應敏感，重復性好。

 

技術背景

 

適配體寡核苷酸分子（ADAPTER OLIGO）是分子生物學中聯動目標片段和載體的接頭，有效實現亞克隆以及后續擴增，尤其對于未知目標DNA分子序列的后續檢測。經過系列末端處理，將諸多互不關聯的DNA分子連成一體。

 

產品內容

 

緩沖液（Reagent A）   5毫升

反應液（Reagent B）       80微升

激酶液（Reagent C）       20微升

活性液（Reagent D） 150微升

激活液（Reagent E）  50微升

酶促液（Reagent F）  10微升

萃取液（Reagent G）   6毫升

濃縮液（Reagent H）   2毫升

助沉液（Reagent I）  20微升

沉淀液（Reagent J）  15毫升

凈化液（Reagent K）  20毫升

連接液（Reagent L）       10微升

產品說明書       1份

 

保存方式

 

保存緩沖液（Reagent A）、濃縮液（Reagent H）、沉淀液（Reagent J）和凈化液（Reagent K）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

適配體：用于連接的目標DNA分子

線性載體：用于克隆的酶切后目標DNA分子

DNA片段：用于連接和克隆的目標DNA分子

1.5毫升離心管：用于樣品反應操作和保存的容器

恒溫水槽或培養箱：用于孵育反應物

震蕩器：用于混勻反應物

4℃微型臺式離心機：用于沉淀樣品

 

實驗步驟

 

實驗開始前，完成好適配體DNA合成、載體酶切、DNA片段等膠純化操作。將恒溫水槽打開，設置37℃和65℃。同時將－20℃保存的試劑，即刻置于冰槽里融化，即刻使用，用畢即刻放回冰箱。

 

• 目標適配體DNA分子磷酸化預處理

 

• 準備2個1.5毫升離心管，標記為1和2號管
• 按照下表依次加入反應物：

	1號管	2號管
用戶自備的單鏈適配體A	2微升（總量1微克）	――
用戶自備的單鏈適配體B	――	2微升（總量1微克）
緩沖液（Reagent A）	13微升	13微升
反應液（Reagent B）	4微升	4微升
激酶液（Reagent C）	1微升	1微升
總量	20微升	20微升

 

• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 放進37℃恒溫水槽孵育30分鐘
• 放進65℃恒溫水槽孵育20分鐘
• 2管合并1管
• 加入10微升活性液（Reagent D），混勻
• 煮沸2分鐘
• 置于室溫下，靜置15分鐘
• 移取1微升到新的1.5毫升離心管
• 加入9微升緩沖液（Reagent A），混勻后，標記為適配體工作液
• 放進－20℃冰箱保存備用

 

• 目標載體DNA分子去磷酸化預處理

 

• 準備1個1.5毫升離心管
• 加入2微升用戶自備的酶切后線性載體（總量為1微克）
• 加入5微升激活液（Reagent E）
• 加入42微升緩沖液（Reagent A）
• 加入1微升酶促液（Reagent F）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 放進37℃恒溫水槽孵育30分鐘
• 加入150微升緩沖液（Reagent A）
• 加入200微升萃取液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 重復實驗步驟10至13一次
• 加入60微升濃縮液（Reagent H）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reeagent I）
• 加入600微升沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent K）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入15微升緩沖液（Reagent A），直至溶解
• 放進－20℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

• 連接

 

• 準備1個1.5毫升離心管
• 加入2微升上述制備的適配體工作液
• 加入1微升上述制備的去磷酸化載體（總量為50納克）
• 加入1微升用戶自備的目標DNA分子（總量為50納克）
• 加入2.5微升活性液（Reagent D）
• 加入1微升連接液（Reagent L）
• 加入17.5微升緩沖液（Reagent A）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心5秒
• 放進16℃恒溫水槽孵育16小時
• 加入200微升緩沖液（Reagent A）
• 加入200微升萃取液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進4℃微型臺式離心機瞬時離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入60微升濃縮液（Reagent H）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reeagent I）
• 加入600微升沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
• 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升凈化液（Reagent K）
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入10微升緩沖液（Reagent A），直至溶解
• 放進－20℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

 

注意事項

 

• 本產品為10次操作
• 操作時，須戴手套
• 所有操作均須在4℃狀態下進行，除另有說明外
• 嚴格按照操作規程進行
• 建議使用帶濾芯的槍頭進行分子操作
• 用戶自備的適配體、載體和目標DNA分子均須膠純化處理
• 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 本公司提供系列DNA連接試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

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