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同位素核酸（PCR產物）蛋白結合DNA酶足跡法分析試劑盒產品說明書
（中文版）
主要用途
同位素核酸（PCR產物）蛋白結合DNA酶足跡法分析試劑是一種旨在通過同位素標記PCR反應產物，與目標蛋白進行體外結合反應，進而經DNA酶隨機消化處理后，在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜上，觀察核酸－蛋白結合的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于DNA復制、重組、修復、轉錄、病毒組裝中的DNA和蛋白質的相互作用的研究。廣泛應用于定性檢測DNA-蛋白結合和定位檢測特異性DNA結合序列及其突變形成等。產品即到即用，性能穩定，操作便捷，敏感度高，足跡清晰，重復性好。
技術背景
DNA和蛋白質的相互作用是調控細胞反應過程的要素之一。DNA酶足跡法技術（DNase I Footprinting Assay）是一項確定DNA和蛋白質相互作用，例如激素受體復合物與激素反應元素的結合，轉錄因子與操縱子（operator）、增強子（enhancer）和沉默子（silencer）的結合等，分析基因調控，定性或定位檢測特定蛋白的DNA結合序列的主要分析技術之一。首先，目標DNA克隆或擴增分離純化出來，進行單鏈單末端同位素標記，然后與目標蛋白進行體外結合反應，進而使用DNA酶I隨機切離，產生一系列不同長度的DNA片段，其中結合部位的DNA由于空間位阻等多種效應，無法降解（DNA酶保護作用），在變性丙烯酰胺凝膠電泳圖譜上，出現條帶強度的減弱或缺失，形成“足跡”。進而對未經結合反應的同一區域條帶進行測序，獲得特定蛋白質所結合的核苷酸序列。
產品內容
酶標液（Reagent A） 50微升
補充液（Reagent B） 1毫升
反應液（Reagent C） 300微升
萃取液（Reagent D） 6毫升
濃縮液（Reagent E） 2毫升
助沉液（Reagent F） 20微升
沉淀液（Reagent G） 20毫升
凈化液（Reagent H） 20毫升
保存液（Reagent I） 1毫升
緩沖液（Reagent J） 100微升
去干擾液（Reagent K） 20微升
強化液（Reagent L） 500微升
消化液（Reagent M） 20微升
終止液（Reagent N） 1毫升
上樣液（Reagent O） 100微升
產品說明書 1份
保存方式
保存酶標液（Reagent A）、反應液（Reagent C）、萃取液（Reagent D）、助沉液（Reagent F）、緩沖液（Reagent J）、去干擾液（Reagent K）、消化液（Reagent M）和終止液（Reagent N）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；上樣液（Reagent O），避免光照；有效保證6月
用戶自備
寡核苷酸引物探針：用于擴增目標DNA分子
粗提核蛋白（30023）或細胞總蛋白（30002）：待測樣品
同位素γATP32P：用于標記探針
0.5毫升PCR管：用于PCR擴增反應操作的容器
1.5毫升離心管：用于反應操作的容器
干式恒溫儀或恒溫水槽：用于孵育反應物
微型臺式離心機：用于樣品操作
PCR儀：用于擴增反應
聚丙烯酰胺凝膠和聚丙烯酰胺尿素凝膠：用于產物電泳分離
電泳儀：用于電泳操作的儀器
干膠儀：用于電泳后凝膠烘干
X光片：用于X光放射顯影
放射性測讀儀：用于同位素放射性定量
實驗步驟
- 引物標記
- 開啟37℃和70℃干式恒溫儀
- 準備1個1.5毫升離心管
- 按照下表依次加入反應物
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內容物 |
反應用量 |
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酶標液（Reagent A） |
5微升 |
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用戶自備的上游引物 |
1微升（總量350納克） |
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同位素γATP32P |
1微升（150微居里） |
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補充液（Reagent B） |
總量至10微升 |
- 分別渦旋震蕩3秒
- 放進微型臺式離心機瞬時離心
- 放進37℃干式恒溫儀，孵育1小時
- 放進70℃干式恒溫儀，孵育10分鐘
- 放進－20℃冰箱里備用
- 擴增反應
- 準備1個0.5毫升PCR管，置于冰槽里
- 按照下表依次加入反應物
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內容物 |
樣品管 |
|
反應液（Reagent C） |
30微升 |
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同位素標記的上游引物 |
10微升 |
|
未標記的下游引物 |
1微升（總量350納克） |
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模板DNA |
1微升（總量100納克） |
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補充液（Reagent B） |
8微升 |
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總量 |
50微升 |
- 混勻
- 即刻放進PCR儀，按照下表擴增
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反應溫度（℃） |
反應時間 |
反應循環 |
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94 |
2分鐘 |
1 |
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94 |
30秒 |
30
|
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Tm |
30秒 |
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|
72 |
30秒 |
|
|
72 |
5分鐘 |
1 |
三、膠純化
- 準備一個10％聚丙烯酰胺（19：1）凝膠（建議1.5mm厚，10條泳道，垂直電泳）
- 擴增產物電泳
- 切離目標條帶
- 洗脫DNA（容量為300微升）（注意：建議使用聚丙烯酰胺凝膠粉碎法膠回收試劑盒-20008.1）
- 加入300微升萃取液（Reagent D）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管
- 加入100微升濃縮液（Reagent E）到新的離心管
- 加入1微升助沉液（Reagent F）
- 加入800微升沉淀液（Reagent G）
- 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
- 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000 RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升凈化液（Reagent H）
- 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000 RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空氣中晾干沉淀顆粒群
- 定量沉淀顆粒的放射性
- 加入適量的保存液（Reagent I）（50000 CPM/微升），溶解顆粒群
- 放進4℃冰箱里保存（注意：不宜超過1周）
四、結合反應
- 準備2個1.5毫升離心管
- 按照下表依次加入反應物
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內容物 |
結合反應 |
陰性對照反應 |
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緩沖液（Reagent J） |
5微升 |
5微升 |
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標記擴增產物 |
2微升（總量100K CPM） |
2微升（總量100K CPM） |
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去干擾液（Reagent K） |
1微升 |
1微升 |
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待測樣品（粗提核蛋白） |
2微升（總量100微克） |
2微升（BSA總量100微克） |
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補充液（Reagent B） |
總量至50微升 |
總量至50微升 |
- 渦旋震蕩3秒
- 分別放進微型臺式離心機瞬時離心
- 分別放進25℃恒溫水槽孵育30分鐘
五、消化反應
- 分別加入50微升強化液（Reagent L）
- 分別加入2微升消化液（Reagent M），混勻
- 室溫下孵育2分鐘
- 即刻分別加入100微升終止液（Reagent N），混勻
- 分別放進50℃恒溫水槽孵育30分鐘
- 加入300微升萃取液（Reagent D）
- 渦旋震蕩15秒
- 放進微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管
- 加入100微升濃縮液（Reagent E）到新的離心管
- 加入1微升助沉液（Reagent F）
- 加入800微升沉淀液（Reagent G）
- 在渦旋震蕩儀上震蕩15秒，充分混勻
- 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000 RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
- 小心抽掉上清液
- 加入1毫升凈化液（Reagent H）
- 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000 RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心抽掉上清液
- 空氣中晾干沉淀顆粒群
- 定量沉淀顆粒的放射性
- 加入適量的上樣液（Reagent O）（1000 CPM/微升），溶解顆粒群
- 煮沸90秒
- 置入冰槽里等待上樣
六、電泳分析
- 準備一個6％聚丙烯酰胺尿素凝膠
- 上樣：3微升
- 在4℃環境下預運行30分鐘，電壓為1500伏
- 繼續4℃環境下電泳，電壓為1500伏，直至染料到達距離底部至3厘米處
- 固定、干膠
- 干膠后，用保鮮膜包住
- 置于X光片夾壓片，－80℃冰箱里孵育1至5小時
- 顯影觀察
注意事項
- 本產品為10次操作
- 操作時，須戴手套
- 同位素操須嚴格遵守規章制度
- 同位素γATP32P，建議使用AMERSHAN（安瑪西亞）公司
- 建議使用新鮮同位素材料
- 建議探針標記后即刻使用
- 通常PCR產物標記為100至500堿基，小于200堿基為佳
- 電泳前注意清洗樣品孔
- 電泳建議在4℃環境下進行，注意安全
- 曝光時間需根據情況調整
- 本公司提供系列蛋白研究產品
質量標準
- 本產品經鑒定性能穩定
- 本產品經鑒定顯影清晰
24小時電話： 13311756131
客服: QQ:2851717098
