人體SEPT9（septin-9）基因甲基化檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(中文版)

主要用途

人體SEPT9（septin-9）基因甲基化檢測(cè)試劑是一種旨在通過化學(xué)方法使基因組中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）轉(zhuǎn)變成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，經(jīng)過甲基化特異性PCR擴(kuò)增，探測(cè)到人體SEPT9啟動(dòng)子CpG島甲基化信息的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的�？梢员挥糜赟EPT9相關(guān)的人體細(xì)胞或組織以及血漿DNA表觀遺傳學(xué)研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化保證。

 

技術(shù)背景

 

在基因的啟動(dòng)子區(qū)域（promotor region）通常存在一些富含重復(fù)雙核苷酸“CG”的區(qū)域，稱為“CpG島”（CpG island）。在人類基因組內(nèi)，存在有近3萬(wàn)個(gè)CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標(biāo)志，而且還參與基因表達(dá)的調(diào)控和影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，更是DNA甲基化的唯一位置。CpG島甲基化形態(tài)的掃描分析是基因表達(dá)和表觀基因組學(xué)的主要課題。SEPT（septin）屬于GTP結(jié)合蛋白家屬成員，由14個(gè)成員組成。SEPT9（septin-9）為一組支架蛋白（scaffolding protein），在細(xì)胞分裂時(shí)，提供結(jié)構(gòu)支撐，控制細(xì)胞骨架，作用于細(xì)胞偽足（seudopod）變化等。作為腫瘤抑制基因，與腫瘤細(xì)胞繁殖、遷移、生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。基因甲基化導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致直腸癌、前列腺癌、乳房癌等發(fā)生和發(fā)展。由此SEPTIN9甲基化成為早期腫瘤和非轉(zhuǎn)移性腫瘤的診斷標(biāo)志，尤其是直腸癌。 

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

緩沖液（Reagent A）  2 X 1.5 毫升

變性液（Reagent B） 250微升

處理液（Reagent C）   1毫升

轉(zhuǎn)化液（Reagent D）  12毫升

封隔液（Reagent E）   3毫升

凈化液（Reagent F）  20毫升

萃取液（Reagent G）   40毫升

濃縮液（Reagent H）   2毫升

助沉液（Reagent I）  20微升

沉淀液（Reagent J）  10毫升

清理液（Reagent K）    20毫升

保存液（Reagent L）   1毫升

擴(kuò)增液（Reagent M） 900微升

補(bǔ)充液（Reagent N）   1毫升

 U引物F（Reagent O）  20微升

 U引物R（Reagent P）  20微升

 M引物F（Reagent Q）  20微升

 M引物R（Reagent R）  20微升

針筒離心柱  20套

產(chǎn)品說(shuō)明書   1份

 

保存方式

 

保存處理液（Reagent C）、轉(zhuǎn)化液（Reagent D）、助沉液（Reagent I）、擴(kuò)增液（Reagent M）、補(bǔ)充液（Reagent N）、 U引物F（Reagent O）、 U引物R（Reagent P）、 M引物F（Reagent Q）和 M引物R（Reagent R）在－20℃冰箱里；凈化液（Reagent F）和針筒離心柱保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；處理液（Reagent C）和轉(zhuǎn)化液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)物

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀樣品或去除雜質(zhì)

渦旋震蕩儀：用于混勻反應(yīng)物

真空泵：用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞：用于去除樣品中的液體成分

PCR儀：用于樣品擴(kuò)增

PCR管或平板：用于PCR反應(yīng)的容器

測(cè)序試劑盒：用于測(cè)序前的產(chǎn)物處理

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

實(shí)驗(yàn)開始前，將處理液（Reagent C）和轉(zhuǎn)化液（Reagent D）從－20℃冰箱中取出，置入室溫下。同時(shí)將其中一管緩沖液（Reagent A）置入65℃恒溫水槽中預(yù)熱備用。然后進(jìn)行下列操作：

 

• 轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

 

• 準(zhǔn)備1個(gè)2.0毫升離心管
• 加入2微克DNA樣品
• 加入適量的緩沖液（Reagent A）到50微升反應(yīng)體系（注意：不要使用65℃預(yù)熱的緩沖液（Reagent A））
• 加入5.5微升變性液（Reagent B），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入30微升處理液（Reagent C）（注意：可見溶液呈現(xiàn)黃色）
• 在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒，充分混勻
• 加入520微升轉(zhuǎn)化液（Reagent D），上下傾倒混勻
• 加入100微升封隔液（Reagent E）
• 放進(jìn)55℃恒溫水槽孵育16小時(shí)
• 小心抽去100微升封隔液（Reagent E）
• 加入1毫升充分搖勻的凈化液（Reagent F），上下傾倒混勻（注意：凈化液（Reagent F）出現(xiàn)沉淀，37℃溫育后使用）
• 移入到針筒離心柱
• 連接到真空泵，將柱內(nèi)液體抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）
• 加入1毫升萃取液（Reagent G）
• 運(yùn)用真空泵，將萃取液（Reagent G）抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內(nèi)液體）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟15至16一次
• 去掉針筒，將離心柱放在1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心30秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉殘余萃取液，更換新的1.5毫升離心管
• 加入50微升65℃預(yù)熱的緩沖液（Reagent A）到離心柱
• 室溫下靜置1分鐘
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心30秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉離心柱
• 加入5.5微升變性液（Reagent B）到離心管，混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入82微升濃縮液（Reagent H）
• 加入1微升助沉液（Reagent I）
• 加入400微升沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩30秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent K）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升保存液（Reagent L）
• 放進(jìn)－20℃冰箱長(zhǎng)期保存

 

二、甲基化特異性PCR

 

• 將擴(kuò)增液（Reagent M）、補(bǔ)充液（Reagent N）、 U引物F（Reagent O）、 U引物R（Reagent P）、 M引物F（Reagent Q）和 M引物R（Reagent R）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對(duì)一個(gè)樣本，準(zhǔn)備2個(gè)PCR管，分別標(biāo)記為U和M管
• 分別移出15微升擴(kuò)增液（Reagent M）到PCR管里
• 分別加入1微升上述轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入1微升 U引物F（Reagent O）和 U引物R（Reagent P）到U管中
• 分別加入1微升 M引物F（Reagent Q）和 M引物R（Reagent R）到M管中
• 再分別加入7微升補(bǔ)充液（Reagent N）（反應(yīng)總量為25微升）
• 即刻放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)瞬時(shí)離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級(jí)礦物油（注意：參見注意事項(xiàng)9）
• 即刻進(jìn)行熱啟動(dòng)PCR反應(yīng)：

 

溫度（℃）	時(shí)間	循環(huán)
95	2分鐘	1
95 58 72	30秒 90秒 30秒	35
72	5分鐘	1

 

• 反應(yīng)完畢后，移取5微升進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳
• 陽(yáng)性條帶：轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）――150 bp；轉(zhuǎn)化后甲基型（M）――150 bp

 

注意事項(xiàng)

 

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 一個(gè)特定基因的甲基化特異性PCR通常包括：轉(zhuǎn)化后甲基型（M）、轉(zhuǎn)化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設(shè)計(jì)原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個(gè)CpG位點(diǎn)；CpG位點(diǎn)須在3端；PCR片段長(zhǎng)度在80－250堿基
•  U引物F（Reagent O）、 U引物R（Reagent P）、 M引物F（Reagent Q）和 M引物R（Reagent R）的信息如下：

 

引物名稱	序列	Tm（℃）	GeneID	片段
M引物F（Reagent Q）	5- TCCGAAATAATCCAACT-3	58	NG011683	150
M引物R（Reagent R）	5- CGTAGGGTTCGGGTTTCGT -3	58	NG011683	150
U引物F（Reagent O）	5-GTGTAGTTGGATGGGATTATT-3	58	NG011683	150
U引物R（Reagent P）	5- CCATCTCCCCTCAACACACTCCCA-3	58	NG011683	150

 

• 通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增后的結(jié)果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴(kuò)增

         

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現(xiàn)“U”和“M”同時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性；建議使用基因甲基化程度定量分析試劑盒（20024.3）予以分析
• 根據(jù)用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 必要時(shí)，可以調(diào)整Tm溫度 
• 在－20℃冰箱里儲(chǔ)存的產(chǎn)品避免反復(fù)凍融
• 轉(zhuǎn)化后的DNA保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融
• 本公司同時(shí)提供數(shù)字化表觀基因組完全分析（全部甲基化基因）技術(shù)試劑盒和外包服務(wù)（90002）
• 本公司同時(shí)提供系列甲基化分析試劑產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定轉(zhuǎn)化保證
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定反應(yīng)產(chǎn)量高

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