小鼠雌激素受體β（ERβ）基因甲基化檢測試劑盒產品說明書(中文版)

 

主要用途

 

小鼠雌激素受體β（ERβ）基因甲基化檢測試劑是一種旨在通過化學方法使基因組中的所有胞嘧啶（CYTOSINE）轉變成尿嘧啶（URACIL），而保留了所有甲基化的胞嘧啶，經過甲基化特異性PCR擴增，探測到雌激素受體β基因啟動子CpG島甲基化信息的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。可以被用于雌激素受體β基因相關的病理表觀遺傳學研究。產品即到即用，性能穩定，操作簡便，轉化保證。

 

技術背景

 

在基因的啟動子區域（promotor region）通常存在一些富含重復雙核苷酸“CG”的區域，稱為“CpG島”（CpG island）。在人類基因組內，存在有近3萬個CpG島。這些CpG島不僅是基因的一種標志，而且還參與基因表達的調控和影響染色質的結構，更是DNA甲基化的唯一位置。CpG島甲基化形態的掃描分析是基因表達和表觀基因組學的主要課題。雌激素受體β（estrogen receptorβ；ERβ），又稱為核受體亞群3A組成員2 （nuclear receptor subfamily 3 group A member 2；NR3A2），是一種核受體，受到性激素雌激素（estrogen）激活。在體內許多組織中表達，如血液單核細胞，組織巨噬細胞，腸道和肺組織上皮細胞，以及前列腺上皮組織等。雌激素受體β具有抗細胞繁殖作用。小鼠鼠作為模式動物，其ERβ）基因和人體ERβ）基因同源。其啟動子甲基化與小鼠疾病密切相關。

 

產品內容

 

緩沖液（Reagent A）  2 X 1.5 毫升

變性液（Reagent B） 250微升

處理液（Reagent C）   1毫升

轉化液（Reagent D）  12毫升

封隔液（Reagent E）   3毫升

凈化液（Reagent F）  20毫升

萃取液（Reagent G）   40毫升

濃縮液（Reagent H）   2毫升

助沉液（Reagent I）  20微升

沉淀液（Reagent J）  10毫升

清理液（Reagent K）    20毫升

保存液（Reagent L）   1毫升

擴增液（Reagent M） 900微升

補充液（Reagent N）   1毫升

 U引物F（Reagent O）  20微升

 U引物R（Reagent P）  20微升

 M引物F（Reagent Q）  20微升

 M引物R（Reagent R）  20微升

針筒離心柱  20套

產品說明書   1份

 

保存方式

 

保存處理液（Reagent C）、轉化液（Reagent D）、助沉液（Reagent I）、擴增液（Reagent M）、補充液（Reagent N）、 U引物F（Reagent O）、 U引物R（Reagent P）、 M引物F（Reagent Q）和 M引物R（Reagent R）在－20℃冰箱里；凈化液（Reagent F）和針筒離心柱保存在室溫下；其余的保存在4℃冰箱里；處理液（Reagent C）和轉化液（Reagent D）避免光照；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

2.0毫升離心管：用于樣品操作的容器

恒溫水槽：用于孵育反應物

微型臺式離心機：用于沉淀樣品或去除雜質

渦旋震蕩儀：用于混勻反應物

真空泵：用于去除樣品中的液體成分

針筒擠壓塞：用于去除樣品中的液體成分

PCR儀：用于樣品擴增

PCR管或平板：用于PCR反應的容器

測序試劑盒：用于測序前的產物處理

 

實驗步驟

 

實驗開始前，將處理液（Reagent C）和轉化液（Reagent D）從－20℃冰箱中取出，置入室溫下。同時將其中一管緩沖液（Reagent A）置入65℃恒溫水槽中預熱備用。然后進行下列操作：

 

• 轉化實驗

 

• 準備1個2.0毫升離心管
• 加入2微克DNA樣品
• 加入適量的緩沖液（Reagent A）到50微升反應體系（注意：不要使用65℃預熱的緩沖液（Reagent A））
• 加入5.5微升變性液（Reagent B），混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入30微升處理液（Reagent C）（注意：可見溶液呈現黃色）
• 在渦旋震蕩儀上小心震蕩30秒，充分混勻
• 加入520微升轉化液（Reagent D），上下傾倒混勻
• 加入100微升封隔液（Reagent E）
• 放進55℃恒溫水槽孵育16小時
• 小心抽去100微升封隔液（Reagent E）
• 加入1毫升充分搖勻的凈化液（Reagent F），上下傾倒混勻（注意：凈化液（Reagent F）出現沉淀，37℃溫育后使用）
• 移入到針筒離心柱
• 連接到真空泵，將柱內液體抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內液體）
• 加入1毫升萃取液（Reagent G）
• 運用真空泵，將萃取液（Reagent G）抽去（或使用用戶自備的針筒擠壓塞擠去柱內液體）
• 重復實驗步驟15至16一次
• 去掉針筒，將離心柱放在1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心30秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉殘余萃取液，更換新的1.5毫升離心管
• 加入50微升65℃預熱的緩沖液（Reagent A）到離心柱
• 室溫下靜置1分鐘
• 放進微型臺式離心機離心30秒，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 去掉離心柱
• 加入5.5微升變性液（Reagent B）到離心管，混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育12分鐘
• 加入82微升濃縮液（Reagent H）
• 加入1微升助沉液（Reagent I）
• 加入400微升沉淀液（Reagent J）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩30秒
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升清理液（Reagent K）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM；例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升保存液（Reagent L）
• 放進－20℃冰箱長期保存

 

二、甲基化特異性PCR

 

• 將擴增液（Reagent M）、補充液（Reagent N）、 U引物F（Reagent O）、 U引物R（Reagent P）、 M引物F（Reagent Q）和 M引物R（Reagent R）從－20℃冰箱里取出
• 置入冰槽里直至融化
• 針對一個樣本，準備2個PCR管，分別標記為U和M管
• 分別移出15微升擴增液（Reagent M）到PCR管里
• 分別加入1微升上述轉化實驗中獲得的DNA樣品（總量100納克）
• 分別加入1微升 U引物F（Reagent O）和 U引物R（Reagent P）到U管中
• 分別加入1微升 M引物F（Reagent Q）和 M引物R（Reagent R）到M管中
• 再分別加入7微升補充液（Reagent N）（反應總量為25微升）
• 即刻放進微型臺式離心機瞬時離心5秒，速度為500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）
• 加入50微升PCR級礦物油（注意：參見注意事項9）
• 即刻進行熱啟動PCR反應：

 

溫度（℃）	時間	循環
95	2分鐘	1
95 60 72	30秒 90秒 30秒	35
72	5分鐘	1

 

• 反應完畢后，移取5微升進行1.8%瓊脂糖凝膠電泳
• 陽性條帶：轉化后非甲基型（U）――115 bp；轉化后甲基型（M）――116 bp

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
• 建議使用帶濾芯的槍頭，避免污染
• 一個特定基因的甲基化特異性PCR通常包括：轉化后甲基型（M）、轉化后非甲基型（U）
• 甲基化特異性PCR的引物設計原則：引物以SENSE的DNA鏈為模板；引物含有足夠多的C（后面不和G相連）；引物含有1－3個CpG位點；CpG位點須在3端；PCR片段長度在80－250堿基
•  U引物F（Reagent O）、 U引物R（Reagent P）、 M引物F（Reagent Q）和 M引物R（Reagent R）的信息如下：

 

引物名稱	序列	Tm（℃）	GeneID	片段
M引物F（Reagent Q）	5- TTGAGCGATAATTAGTGGTTGC -3	60	NM_010157	116
M引物R（Reagent R）	5- TCACGAACAAATAAAATACCTAACG -3	60	NM_010157	116
U引物F（Reagent O）	5- TTGAGTGATAATTAGTGGTTGTGA -3	60	NM_010157	115
U引物R（Reagent P）	5- CACAAACAAATAAAATACCTAACAAA-3	60	NM_010157	115

 

• 通過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳來檢測PCR擴增后的結果。假如DNA樣品在修飾前是未甲基化的，那么僅僅“U”Primers將產生擴增產物；相反，已甲基化的DNA樣品僅僅用“M”Primer能被擴增

         

• 組織樣品或雜合子樣品常常出現“U”和“M”同時呈現陽性；建議使用基因甲基化程度定量分析試劑盒（20024.3）予以分析
• 根據用戶PCR儀的性能，決定是否加入礦物油（Mineral Oil）
• 必要時，可以調整Tm溫度 
• 在－20℃冰箱里儲存的產品避免反復凍融
• 轉化后的DNA保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融
• 本公司同時提供數字化表觀基因組完全分析（全部甲基化基因）技術試劑盒和外包服務（90002）
• 本公司提供系列甲基化分析試劑產品

 

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定轉化保證
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定反應產量高

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