精子細胞線粒體DNA萃取試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

精子細胞線粒體DNA萃取試劑是一種旨在通過等密度離心獲取動物成熟精子細胞，進而物理破膜，分離出完整而純化的線粒體細胞器，然后在生物酶處理下，獲得高質量的線粒體DNA的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種動物精子細胞的線粒體核酸成分的分離。用于后續的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產品即到即用，操作簡易，性能穩定，無核酶污染，萃取純度和產量皆高。

技術背景

線粒體細胞器的研究是現代細胞生物學的最重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細胞凋亡、腫瘤、HIV、老年癡呆癥、糖尿病、肌肉疾病等研究的主要對象。其中成熟動物精子細胞約有22至75個線粒體，位于精子鞭毛（flagellum）中段（midpiece）；提供能量作為精子運動。每個線粒體有50至75個DNA拷貝數。一旦受精，線粒體DNA快速降解。精子線粒體DNA與精子的功能，例如運動和不育密切相關。如果出現DNA突變、缺失、含量減少，將會導致弱精子癥（Asthenozoospermia）和少弱精子癥（oligoasthenozoospermia）等。 

產品內容

高純液（Reagent A）    60毫升

低純液（Reagent B）    60毫升

保存液（Reagent C）    40毫升

裂解液（Reagent D）   100毫升

破膜液（Reagent E）          6毫升

去干擾液（Reagent F）   600微升

酶解液（Reagent G）   600微升

萃取液（Reagent H）     6毫升

濃縮液（Reagent I）     2毫升

助沉液（Reagent J）    20微升

沉淀液（Reagent K）    20毫升

純化液（Reagent L）    20毫升

緩沖液（Reagent M）     1毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存裂解液（Reagent D）、去干擾液（Reagent F）、酶解液（Reagent G）、萃取液（Reagent H）和助沉液（Reagent J）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

渦旋震蕩儀：用于混勻

4℃（微型）臺式離心機：用于樣品操作

4℃超速離心機：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

58℃恒溫水槽：用于孵育反應物

實驗步驟

• 樣品預處理

• 移取2毫升新鮮收集（48小時內）的精液到2毫升離心管（注意：建議精子細胞總量為5 X 10⁷）
• 放進37℃培養箱孵育20分鐘 
• 準備一個15毫升錐形離心管
• 加入3毫升高純液（Reagent A）
• 小心加入3毫升低純液（Reagent B）在上述高純液（Reagent A）的上面（注意：避免震蕩）
• 小心加入2毫升精液在上述低純液（Reagent B）的上面（注意：避免震蕩）
• 放進臺式離心機離心20分鐘，速度為300g
• 小心移取高純液（Reagent A）和低純液（Reagent B）交界面上的精子細胞——此為不成熟精子細胞（注意：如果檢測不成熟精子細胞，可以加入保存液（Reagent C）保留）
• 小心移取管底精子細胞顆粒群到新的1.5毫升離心管——此為成熟精子細胞
• 加入2毫升保存液（Reagent C），混勻成熟精子細胞顆粒群
• 放進冰槽里孵育20分鐘
• 放進臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液
• 放進冰槽里備用

• 線粒體DNA分離

• 加入預冷的5毫升裂解液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20至40下）（注意：參考注意事項7） 
• 將所有勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent E）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent F）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時（注意：可以孵育4至16小時，增加萃取產量） 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent H）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent I）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent J）
• 加入800微升沉淀液（Reagent K）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent L）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent M）
• 溶解后放進－20℃冰箱長期保存或移出2微升進行PCR反應

注意事項

• 本產品為20次（5 X 10⁷精子細胞）操作
• 操作時，須戴手套
• 所有操作均須無菌狀態下進行，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent D） 
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態進行
• 建議使用足夠的樣品量
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數為20至40下達到80％的細胞裂解為理想狀態。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度。低于50％可以增加勻化次數
• 試劑中的溶液使用前搖勻；酶解液（Reagent G）需放進37℃溫育少許；為避免反復凍融，建議適量分裝
• 可以通過增加線粒體溶解時間（30分鐘）和酶解時間（直至16小時），獲得大量的DNA產量
• 通常 5 X 10⁷精子細胞中提取的線粒體DNA達1至10微克
• 本公司提供系列線粒體技術產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定萃取產量和純化程度高

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