高多糖/酚植物線粒體DNA萃取試劑盒產品說明書（中文版）

 

主要用途

 

高多糖/酚植物線粒體DNA萃取試劑是一種旨在通過物理或化學破膜及離心處理方法，從植物細胞或組織中去除多糖和多酚之后，分離出完整而純化的線粒體細胞器，然后進一步生物酶處理以獲得高質量的線粒體DNA的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種新鮮的含有大量多糖和酚的植物組織，包括葉片（leaf）、谷粒（grain）、種子（seed）、以及培養細胞的線粒體核酸成分的分離。用于后續的雜交、克隆、酶切、PCR分析等。產品即到即用，操作簡易，性能穩定，無核酶污染，萃取純度和產量皆高。 

 

技術背景

 

線粒體細胞器的研究是現代細胞生物學的最重要的課題之一。線粒體成為生物衰老、古生物、細胞凋亡、能量代謝等研究的主要對象。線粒體DNA的分離和定量以及突變分析是研究中必不可少的。 

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）   200毫升

裂解液（Reagent B）    80毫升

凈化液（Reagent C）    20毫升

強化液（Reagent D）    10毫升

保存液（Reagent E）   100毫升

破膜液（Reagent F）          6毫升

去干擾液（Reagent G）        600微升

酶解液（Reagent H）        600微升

萃取液（Reagent I）     6毫升

濃縮液（Reagent J）     2毫升

助沉液（Reagent K）    20微升

沉淀液（Reagent L）    20毫升

純化液（Reagent M）    20毫升

緩沖液（Reagent N）     1毫升

產品說明書 1份

 

保存方式

 

保存凈化液（Reagent C）、去干擾液（Reagent G）、酶解液（Reagent H）、萃取液（Reagent I）和助沉液（Reagent K）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

 

 

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放

50毫升錐形離心管：用于細胞或組織收集后離心或清洗

1.5毫升離心管：用于保存線粒體

4℃臺式離心機：用于沉淀細胞

4℃超速離心機：用于分離細胞器成分

微型臺式離心機：用于沉淀核酸

尼龍絲或60微米尼龍網：用于去除植物裂解殘渣

小型漏斗：用于過濾的裝置

DOUNCE勻漿器：用于裂解細胞

58℃恒溫水槽：用于孵育反應物

渦旋震蕩儀：用于混勻

 

實驗步驟

 

• 植物組織線粒體DNA分離（物理法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進一個預冷的15毫升錐形離心管
• 加入預冷的5毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項7）
• （選擇步驟）準備1個小型漏斗，內襯尼龍絲或60微米尼龍網，置于50毫升錐形離心管上
• （選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過濾（注意：可以使用4層紗布替代）
• 將所有組織勻漿物移入15毫升錐形離心管，放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質體等殘渣
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱長期保存或移出2微升進行PCR反應

 

• 植物組織線粒體DNA分離（化學法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進預冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入10毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放進液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進一個15毫升錐形離心管
• 加入預冷的5毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預冷的500微升強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入預冷的5毫升保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• （選擇步驟）準備1個小型漏斗，內襯尼龍絲或60微米尼龍網，置于50毫升錐形離心管上
• （選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過濾（注意：可以使用4層紗布替代）
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質體等殘渣
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉入1.5毫升離心管
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱長期保存或移出2微升進行PCR反應

 

• 植物細胞或原生質體線粒體DNA分離（物理法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備5 X 10⁷植物細胞或原生質體
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的5毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細胞顆粒群
• 即刻放進預冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約80下）（注意：參見注意事項7）
• 將所有細胞勻漿物移入15毫升錐形離心管，放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質體等殘渣
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱長期保存或移出2微升進行PCR反應

• 植物細胞或原生質體線粒體DNA分離（化學法）

 

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備5 X 10⁷植物細胞或原生質體
• 移入一個50毫升錐形離心管
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入10毫升預冷的清理液（Reagent A），混勻細胞
• 放進臺式離心機離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預冷的5毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• （選擇步驟）超聲波處理1分鐘
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預冷的500微升強化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）
• 加入預冷的5毫升保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
• 放進4℃臺式離心機離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預冷的15毫升錐形離心管（如果上清液含有肉眼可見的殘渣，重復離心5分鐘一次，速度為3000g）——此步驟去除細胞壁、淀粉顆粒、細胞核和未溶解的細胞以及完整質體等殘渣
• 放進4℃超速離心機離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物（注意：如果暫時停止操作，須暫時放進－70℃冰箱里）
• 加入300微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 渦旋震蕩15秒，混勻顆粒群
• 轉入1.5毫升離心管
• 置入冰槽中孵育15分鐘 
• 加入30微升去干擾液（Reagent G）
• 用200微升槍頭上下抽吸混勻
• 放進37℃恒溫水槽孵育15分鐘
• 加入30微升酶解液（Reagent H）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進58℃恒溫水槽孵育2小時 
• 置于室溫下冷卻15分鐘，直至處于室溫狀態（或置于冰槽里15至30秒）
• 加入300微升萃取液（Reagent I）（注意：使用前搖勻）
• 渦旋震蕩5秒
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 移出上層液相溶液到新的1.5毫升離心管（注意：切莫觸碰液相交界面上的白色膜狀物）
• 加入100微升濃縮液（Reagent J）到新的離心管
• 加入1微升助沉液（Reagent K）
• 加入800微升沉淀液（Reagent L）
• 在渦旋震蕩儀上震蕩5秒，充分混勻
• 放進微型臺式離心機離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：離心前做好方位標記，以便離心后觀察管底沉淀顆粒）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升純化液（Reagent M）
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 空氣中晾干沉淀顆粒群
• 加入20微升緩沖液（Reagent N）
• 溶解后放進－20℃冰箱長期保存或移出2微升進行PCR反應

 

注意事項

 

• 本產品為20次操作（1克植物組織或5 X 10⁷細胞）
• 線粒體操作均須在4℃或以下狀態下進行
• 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的組織或細胞量
• 建議植物組織使用組織勻漿器操作；德國的BRAUN細胞勻漿器最為理想
• 建議嚴格控制操作時間
• 通常勻化次數為80下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加勻化次數
• 通常孵育5分鐘達到80％的細胞裂解為理想狀態，但不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現發亮的圓環。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數
• 裂解液（Reagent B）具有強力吸附并去除多糖和酚類物質的作用
• 不同組織，其線粒體含量不同；通常1克植物組織的線粒體含量為10至50微克線粒體蛋白
• 試劑中的溶液使用前搖勻；去干擾液（Reagent G）和酶解液（Reagent H）需放進37℃溫育少許；為避免反復凍融，建議適量分裝
• 通常1克植物組織或5 X 10⁷細胞中提取的線粒體DNA達1至10微克

13． 本產品所獲得的線粒體DNA純度和產量最為理想，確保無核DNA和外源性DNA污染

• 本公司提供系列植物線粒體分析技術產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定無核酶污染
• 本產品經鑒定萃取產量和純化程度高
• 本產品經鑒定無基因組DNA污染

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