精子細胞ATP生物發光法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

 

主要用途

精子細胞ATP生物發光法定量檢測試劑是一種旨在通過螢火蟲熒光素酶反應系統，熒光素在酶的催化下，與ATP發生反應，產生生物光能，采用冷光儀測定其相對冷光單位的變化，來定量分析精子細胞樣品（包括裂解或懸液）中ATP濃度的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種新鮮或凍存的精子細胞（動物、人體）的ATP檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，高度敏感。

 

技術背景

 

三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細胞內，是細胞活力的標志。在精子細胞中，ATP與精子鞭毛（flagellum）啟動的運動能力和速度有關。ATP水平用于評價精子細胞膜的完整性、線粒體功能、以及精子活力。螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）是62 kd 的單體蛋白，催化ATP依賴性熒光素（luciferin）的氧化，經過電子轉移，將化學能轉化為氧化型熒光素（oxyluciferin）的光能，與ATP量成線性正相關，通過生物發光儀（560nm）檢測，由此定量ATP濃度。其反應方式為：

 

luciferase

ATP  ＋ D-Luciferin ＋ O2  →  Oxyluciferin  ＋ AMP ＋ PPi  ＋ CO2  ＋ Light

            Mg²⁺

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）  200毫升

裂解液（Reagent B）   60毫升

緩沖液（Reagent C）   2.5毫升

反應液（Reagent D）  250微升

標準液（Reagent E）  20微升

產品說明書      1份

 

保存方式

 

保存清理液（Reagent A）和裂解液（Reagent B）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴格避免光照和反復凍融；有效保證3月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于標準液配制的容器

2毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

培養箱：用于精子細胞孵育

血細胞計數器：用于精子細胞計數

測試管：用于發光檢測用的專用試管

黑色96孔板：用于冷光檢測操作的容器

（微型）臺式離心機：用于樣品沉淀

化學發光儀：用于檢測化學發光

 

實驗步驟

 

實驗開始前，從－20℃冰箱里取出試劑，置于室溫下預熱15分鐘，避免光照；設置好冷光儀：溫度22℃，1秒延時（Delay），1秒整合（Integration）檢測。同時關上操作室的燈光。然后進行下列操作。

 

• 待測樣品準備

 

• 移取2毫升新鮮收集（1小時內）的精液到2毫升離心管
• 放進37℃培養箱孵育20分鐘
• 放進微型臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入2毫升清理液（Reagent A），混勻精子細胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心7分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 重復實驗步驟5至7一次
• 加入1毫升裂解液（Reagent B）
• 充分混勻后，在血細胞計數器上進行精子細胞計數
• 調整精子細胞數為 10⁶/毫升
• 煮沸3分鐘
• 放進冰槽里靜置2分鐘
• 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心移取上清液到新的2毫升離心管
• 放進冰槽里待測

 

• 標準樣品準備

 

• 準備好8個無菌的1.5毫升離心管，標記為1至8號管
• 按下表分別加入適量的裂解液（Reagent B）到每個離心管
• 移取5微升標準液（Reagent E）到1號管，混勻
• 小心移取50微升1號管稀釋的標準液（Reagent E）到2號管，混勻
• 小心移取50微升2號管稀釋的標準液（Reagent E）到3號管，混勻
• 小心移取50微升3號管稀釋的標準液（Reagent E）到4號管，混勻
• 以此類推
• 將1至8號管放進冰槽里備用；標準管濃度見下表

 

管號	裂解液（Reagent B）	標準液（Reagent E）	標準ATP濃度
1	495微升	5微升	10－4摩爾/升
2	450微升	50微升1號管	10－5摩爾/升
3	450微升	50微升2號管	10－6摩爾/升
4	450微升	50微升3號管	10－7摩爾/升
5	450微升	50微升4號管	10－8摩爾/升
6	450微升	50微升5號管	10－9摩爾/升
7	450微升	50微升6號管	10－10摩爾/升
8	200微升	空白對照	0

 

• 活性測定

 

測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的緩沖液（Reagent C）置入冰槽里融化，然后移出500微升到新的1.5毫升離心管，加入50微升反應液（Reagent D），輕柔混勻后，置于冰槽里，標記為反應工作液，放在暗室冰槽里備用。然后進行下列操作。

 

• 準備1個黑色96孔酶標板，并做好標記：包括背景空對照孔，標準樣品對照孔，以及待測樣品孔 
• 分別加入50微升裂解液（Reagent B）、稀釋的標準液（Reagent E）和待測樣品
• 分別加入50微升反應工作液 
• 室溫下（22℃），置于平式搖蕩儀孵育2分鐘，速度為50 RPM，避免光照
• 即刻放進冷光儀檢測：1秒延時，1秒檢測
• 獲得相對發光單位（Relative Light Unit；RLU）：標準樣品對照孔或待測樣品孔RLU－背景空對照孔RLU
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為相對發光單位（RLU）；橫座標（X軸）為標準ATP濃度（摩爾）
• 計算樣品ATP濃度（納或微摩爾/毫升或納或微摩爾/10⁶精子細胞）：

 

【根據標準曲線計算所得樣品ATP濃度（納或微摩爾/升） X 樣品稀釋倍數】 

 

注意事項

 

• 本產品為50次操作
• 用戶根據實際情況，選擇5管標準區間范圍
• 所有操作均須無菌狀態下進行
• 操作時，須戴手套
• 建議檢測精子細胞量為10⁶至10⁸；禽類動物的精子細胞量為10⁹
• 建議每個樣品安排3個孔，即重復3次，計算時取其平均值
• 反應液（Reagent C）具有光高度敏感性，因此整個操作須避光進行，避免反復凍融
• 由于ATP無處不在，且熱穩定性。建議使用的槍頭、用具須嚴格無菌，避免重復使用；操作時避免污染試劑溶液，不得用手觸摸試劑容器的內蓋
• 如果用戶沒有冷光儀，可以使用閃爍探測器（scitillation counter 或β計數器）替代，但敏感性較低
• 如果樣品ATP濃度較低，可以整合檢測至10秒
• 如果是注射式冷光儀，建議測試前后使用無離子水沖洗冷光儀注射（injector）管道
• 凍存后的精子細胞ATP水平降低50％
• 本公司提供系列發育生物學檢測試劑產品

 

 

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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