細胞內鈣離子水平動態變化熒光檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

細胞內鈣離子水平動態變化熒光檢測試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Indo-1-AM，與鈣離子結合后，其熒光強度顯著增強，在熒光分光光度儀下測量不同散發波長下相對熒光峰值的比值，來測定細胞內鈣離子水平動態變化的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細胞（動物、人體等）細胞內鈣離子動態水平的檢測。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，檢測敏感。

 

技術背景

 

鈣是人體中的一種重要電介質和礦物質，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結合鈣，其構成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經傳導介質、信使傳導等方面起著重要作用。在細胞內，鈣離子主要儲存在線粒體和內質網等細胞器中。其中細胞內鈣離子水平在調節鈣離子通道，維持細胞內環境鈣離子平衡方面起著重要作用。細胞內鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要線粒體、細胞漿分離。Indo-1 AM（acetoxy-methyl ester），一種具有細胞膜通透性，與鈣離子結合產生熒光的染料，穩定性強，持續時間長達一小時，定位明確，通過其不同散發波長405nm/485nm產生的熒光信號比（激發波長350nm）來精確測定細胞內鈣離子水平的動態變化。 

 

產品內容

 

清理液（Reagent A）      40毫升

染色液（Reagent B） 30微升

介導液（Reagent C）     600微升

飽和液（Reagent D）       2毫升

陰性液（Reagent E）       2毫升

裂解液（Reagent F）     200微升

產品說明書     1份

 

保存方式

 

保存染色液（Reagent B）和介導液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

 

用戶自備

 

1.5毫升離心管：用于工作液配制和樣品操作的容器

細胞培養箱：用于染色孵育

96孔培養板：用于樣品操作的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

細胞流式儀：用于熒光分析

 

實驗步驟

 

• 測定準備

 

• 設定好熒光酶標儀：激發波長350nm，散發波長405nm和485nm
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升介導液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 

 

二、熒光酶標儀檢測

 

• 準備1個96孔細胞培養板，標記為：細胞樣品孔、空白對照孔（不含細胞）、最大對照孔（含細胞）
• 小心抽去細胞樣品孔的培養液
• 加入100微升清理液（Reagent A）到細胞樣品孔里
• 加入100微升飽和液（Reagent D）到最大對照孔里
• 加入100微升陰性液（Reagent E）到空白對照孔里
• 分別加入10微升染色工作液到所有孔里
• 輕輕搖動酶標板，混勻
• 放進37℃細胞培養箱里孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去細胞樣品孔里的上清液
• 小心加入100微升清理液（Reagent A）到細胞樣品孔里
• 重復實驗步驟9和10一次
• 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘
• 加入5微升裂解液（Reagent F）到最大對照孔里
• 放進37℃細胞培養箱里孵育15分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）包括樣品RFU405nm、樣品RFU485nm、空白對照孔RFU405nm、空白對照孔RFU485nm、最大對照孔RFU405nm、最大對照孔RFU485nm
• 計算樣品細胞漿鈣離子濃度

 

【（樣品RFU405nm/樣品RFU485nm）－（空白對照孔RFU405nm/空白對照孔RFU485nm）÷（最大對照孔RFU405nm/最大對照孔RFU485nm－樣品RFU405nm/樣品RFU485nm）】X（空白對照孔RFU485nm/最大對照孔RFU485nm） X 230（納摩爾；解離常數）

 

三、（共聚焦）熒光顯微鏡檢測

 

1． 準備1個待測的細胞爬片

• 小心加上500微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
• 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
• 移取300微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入30微升染色工作液，混勻 
• 小心加上上述含有染色工作液的溶液到樣品上，覆蓋樣品表面
• 放進37℃細胞培養箱里孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去樣品上的染色工作液
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發波長350nm，散發波長420nm（細胞內鈣離子呈現藍色熒光）

 

四、倒置熒光顯微鏡動態檢測

 

• 準備1個48孔培養板的細胞樣品
• 小心抽去培養液
• 小心加入500微升清理液（Reagent A），覆蓋細胞表面
• 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
• 加入300微升清理液（Reagent A） 
• 加入30微升染色工作液，輕輕搖動培養板混勻
• 放進37℃細胞培養箱里孵育15分鐘，避免光照
• 小心抽去染色工作液
• 小心加入500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 小心抽去清理液（Reagent A）
• 小心加入500微升用戶自備的培養液或藥物處理溶液
• 放進37℃細胞培養箱里孵育實驗設定的時間點
• 在倒置熒光顯微鏡下進行實時觀察：激發波長350nm，散發波長405至420nm（細胞內鈣離子呈現藍色熒光）

 

五、細胞流式儀檢測

 

• 將懸浮細胞或脫離細胞（1 X 10⁶細胞）移入到1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心1分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心1分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入300微升清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 加入30微升染色工作液，混勻
• 放進37℃細胞培養箱里孵育60分鐘，避免光照
• 放進微型臺式離心機離心1分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 小心加入500微升新鮮的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進微型臺式離心機離心1分鐘，速度為300g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 小心加入500微升新鮮的清理液（Reagent A），混勻細胞顆粒群
• 放進37℃細胞培養箱里孵育30分鐘
• （選擇步驟）移出5微升到載玻片上，放上蓋玻片
• （選擇步驟）即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發波長350nm，散發波長405至420nm（細胞內鈣離子呈現藍色熒光）
• 即刻進行細胞流式儀雙通道分析：觀察50000個細胞以上

 

激發波長	350nm	350nm
熒光顏色	藍色	綠色
散發波長	420nm	510nm
流式儀通道	FL1	FL2
熒光增強	鈣離子陽性	鈣離子陰性

 

注意事項

 

• 本產品為20次（顯微鏡）或60次（酶標板）操作
• 操作時，須戴手套
• 可以使用熒光分光光度儀檢測
• 如果細胞內酯酶缺失，則建議使用微注射（microinjection）技術
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應完成后即刻進行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調整樣品濃度
• 檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產品

 

質量標準

 

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感

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