文章分享ChIP-seq：如何解開擬南芥復制應激謎團？
2023年7月，在《Molecular Plant》期刊上發表的一篇研究論文“Distinctive and complementary roles of E2F transcription factors during plant replication stress responses”，該研究以擬南芥為對象，探究E2FA和E2FB轉錄因子在植物應對復制應激反應中的作用。
DNA精確復制對生物遺傳穩定性至關重要，但多種因素會引發復制應激，威脅基因組完整性。植物受脅迫時觸發的DDR可能與復制應激增加有關，其DDR依賴ATM和ATR激活，SOG1參與調控，但部分轉錄反應受未知因子影響。擬南芥的E2F家族成員各有“分工”，E2FA和E2FB部分功能還存在重疊，它們在這場關乎植物生死的戰斗中，究竟是如何發揮作用的？
研究人員運用多種實驗方法，借助ChIP-seq技術發現了它們與SOG1之間千絲萬縷的聯系——大量共同靶基因和相近的結合位點，這一發現就像一把鑰匙，似乎要打開植物應對復制應激反應機制的神秘大門。這扇大門背后究竟隱藏著哪些驚人的秘密？讓我們一同深入文章，探尋其中的奧秘吧！
技術路線
DNA精確復制對生物遺傳穩定性至關重要，但多種因素會引發復制應激，威脅基因組完整性。植物受脅迫時觸發的DDR可能與復制應激增加有關，其DDR依賴ATM和ATR激活，SOG1參與調控，但部分轉錄反應受未知因子影響。擬南芥的E2F家族成員各有“分工”，E2FA和E2FB部分功能還存在重疊，它們在這場關乎植物生死的戰斗中，究竟是如何發揮作用的？
研究人員運用多種實驗方法，借助ChIP-seq技術發現了它們與SOG1之間千絲萬縷的聯系——大量共同靶基因和相近的結合位點，這一發現就像一把鑰匙，似乎要打開植物應對復制應激反應機制的神秘大門。這扇大門背后究竟隱藏著哪些驚人的秘密？讓我們一同深入文章，探尋其中的奧秘吧！
技術路線
研究結果
1.E2FA、E2FB與SOG1共享一些靶基因
本研究選用擬南芥作為研究對象，通過ChIP-seq技術分析，對比E2FA、E2FB與SOG1的靶基因并確定它們在靶基因上的結合位點，結果發現三者存在大量共同靶基因，如WEE1基因，它們在靶基因上的結合位點相近。GUS染色實驗發現E2FA/B可獨立于SOG1激活WEE1，表明E2FA/B可能參與復制應激反應。
1.E2FA、E2FB與SOG1共享一些靶基因
本研究選用擬南芥作為研究對象，通過ChIP-seq技術分析，對比E2FA、E2FB與SOG1的靶基因并確定它們在靶基因上的結合位點，結果發現三者存在大量共同靶基因，如WEE1基因，它們在靶基因上的結合位點相近。GUS染色實驗發現E2FA/B可獨立于SOG1激活WEE1，表明E2FA/B可能參與復制應激反應。
圖1. E2FA、E2FB和SOG1共享共同的目標基因，并獨立激活WEE1。
2.E2FB的缺失會嚴重加劇復制壓力引起的生長缺陷
為了探討E2FA和E2FB在復制應激反應中的作用，以pol2a-4突變體為基礎，構建與sog1、e2fa或e2fb的雙突變和三突變體，觀察各突變體的生長表型，結果顯示，e2fb-1 pol2a雙突變體和e2fb-1 pol2a sog1三突變體的生長缺陷比pol2a和pol2a sog1更嚴重，而e2fa-1突變對生長影響不明顯。分析各種突變體的根長數據，發現E2FB而非E2FA對于在持續復制壓力下生長的植物根部生長是必需的。這些結果表明，E2FB有助于植物對復制壓力的響應，即使存在復制缺陷也能維持生長。
為了探討E2FA和E2FB在復制應激反應中的作用，以pol2a-4突變體為基礎，構建與sog1、e2fa或e2fb的雙突變和三突變體，觀察各突變體的生長表型，結果顯示，e2fb-1 pol2a雙突變體和e2fb-1 pol2a sog1三突變體的生長缺陷比pol2a和pol2a sog1更嚴重，而e2fa-1突變對生長影響不明顯。分析各種突變體的根長數據，發現E2FB而非E2FA對于在持續復制壓力下生長的植物根部生長是必需的。這些結果表明，E2FB有助于植物對復制壓力的響應，即使存在復制缺陷也能維持生長。
圖2. E2FB，而不是E2FA，是植物在復制壓力下持續生長所必需的。
3.E2FB在應對復制壓力時正向調節分生組織大小和細胞周期進展
通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，發現復制應激會導致根分生組織大小減小。細胞周期分析顯示，E2FB缺失會延遲S期和G2-M期的進程，表明E2FB正調控細胞周期進程，尤其是在G2期和G2/M轉換期。通過流式細胞術檢測花buds也得到了相同的結果。以上結果表明，E2FB通過復制壓力暴露的細胞中G2期的進展和G2/M期的開始來正向調節細胞周期的進展。
通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，發現復制應激會導致根分生組織大小減小。細胞周期分析顯示，E2FB缺失會延遲S期和G2-M期的進程，表明E2FB正調控細胞周期進程，尤其是在G2期和G2/M轉換期。通過流式細胞術檢測花buds也得到了相同的結果。以上結果表明，E2FB通過復制壓力暴露的細胞中G2期的進展和G2/M期的開始來正向調節細胞周期的進展。
圖3. E2FB缺失，而不是E2FA缺失，通過延遲細胞周期的進展，進一步減少了pol2a背景下的根頂端分生組織長度。
4.復制應激誘導基因受E2Fs和SOG1雙重控制
通過對pol2a、pol2a sog1和e2fb-1 pol2a sog1突變體的莖尖進行RNA-seq分析，發現1095個基因在三種突變體中均上調，這些基因與DNA修復、復制和細胞周期負調控相關。SOG1靶基因可分為三組，分別主要受SOG1調控、受SOG1和E2FB拮抗調控、受E2FA和E2FB冗余激活且部分依賴SOG1，表明E2Fs和SOG1對DDR基因存在復雜的調控關系。
通過對pol2a、pol2a sog1和e2fb-1 pol2a sog1突變體的莖尖進行RNA-seq分析，發現1095個基因在三種突變體中均上調，這些基因與DNA修復、復制和細胞周期負調控相關。SOG1靶基因可分為三組，分別主要受SOG1調控、受SOG1和E2FB拮抗調控、受E2FA和E2FB冗余激活且部分依賴SOG1，表明E2Fs和SOG1對DDR基因存在復雜的調控關系。
圖4. E2FB和SOG1協同控制復制應激誘導的轉錄變化。
5.E2FA、E2FB和SOG1協同促進細胞周期進程
首先構建e2fa-2 e2fb-1 sog1三突變體，用HU誘導復制應激，發現sog1突變體對復制應激略有敏感性，而e2fa、e2fb單突變體以及e2fa-2 e2fb-1雙突變體則無明顯的這種超敏感性。e2fb-1 sog1雙突變體比sog1突變體對HU更敏感，這與E2FB在復制應激反應中比E2FA發揮更重要作用的假設相符。值得注意的是，e2fa-2 e2fb-1 sog1三突變體對HU表現出更強的超敏感性，其根生長在轉移到HU后幾乎完全被阻斷，并且根分生組織中出現細胞死亡。
進一步探究了E2F缺失的影響，研究人員發現，在野生型背景下，E2F缺失可能會引發復制應激。e2fa-2 e2fb-1雙突變體表現出S期延長和總細胞周期長度增加的現象，且這些缺陷在sog1突變體背景下消失，這表明E2F缺失會觸發復制應激，進而導致SOG1依賴的細胞周期延遲。通過對7日齡幼苗根尖的RNA-seq分析，研究人員發現e2fa-2 e2fb-1雙突變體中有148個基因下調，其中73個可能是E2FA或E2FB的直接靶基因；同時有345個基因上調，其中145個是E2FA或E2FB結合的基因，且這些上調基因中43個是SOG1的靶基因，這進一步證實了E2FA和E2FB缺失會觸發復制應激，并導致SOG1依賴的DDR基因激活。
首先構建e2fa-2 e2fb-1 sog1三突變體，用HU誘導復制應激，發現sog1突變體對復制應激略有敏感性，而e2fa、e2fb單突變體以及e2fa-2 e2fb-1雙突變體則無明顯的這種超敏感性。e2fb-1 sog1雙突變體比sog1突變體對HU更敏感，這與E2FB在復制應激反應中比E2FA發揮更重要作用的假設相符。值得注意的是，e2fa-2 e2fb-1 sog1三突變體對HU表現出更強的超敏感性，其根生長在轉移到HU后幾乎完全被阻斷，并且根分生組織中出現細胞死亡。
進一步探究了E2F缺失的影響，研究人員發現，在野生型背景下，E2F缺失可能會引發復制應激。e2fa-2 e2fb-1雙突變體表現出S期延長和總細胞周期長度增加的現象，且這些缺陷在sog1突變體背景下消失，這表明E2F缺失會觸發復制應激，進而導致SOG1依賴的細胞周期延遲。通過對7日齡幼苗根尖的RNA-seq分析，研究人員發現e2fa-2 e2fb-1雙突變體中有148個基因下調，其中73個可能是E2FA或E2FB的直接靶基因；同時有345個基因上調，其中145個是E2FA或E2FB結合的基因，且這些上調基因中43個是SOG1的靶基因，這進一步證實了E2FA和E2FB缺失會觸發復制應激，并導致SOG1依賴的DDR基因激活。
圖5. E2FA、E2FB和SOG1的同時缺失消除了植物對復制應激的耐受性。
圖6. E2F缺失會引發復制壓力、SOG1依賴的細胞周期延遲和DDR基因的激活。
圖6. E2F缺失會引發復制壓力、SOG1依賴的細胞周期延遲和DDR基因的激活。
綜上所述，本研究揭示了一個復雜的轉錄網絡，該網絡在植物應對復制應激反應中發揮著關鍵調控作用，其中E2Fs和SOG1作為核心調節因子，共同維持植物基因組的穩定性和細胞周期的正常運行。
圖7. SOG1、E2FA和E2FB作用于不同的共同靶點，以微調植物DDR。
標簽：
ChIP-seq
染色質免疫共沉淀測序
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