德克薩斯理工大學(xué)工業(yè)、制造和系統(tǒng)工程系Changxue Xu教授課題組使用MicroFab噴墨打印技術(shù)，通過液滴發(fā)生設(shè)備研究了生物打印過程中有/無墨水循環(huán)系統(tǒng)對生物墨水及打印結(jié)果中細(xì)胞分布的影響，實驗表明，打印中墨水循環(huán)可明顯改善細(xì)胞聚集、使細(xì)胞分布均勻，打印后細(xì)胞均勻分布，在促進細(xì)胞存活（培育3天從77%增到92%）和增殖（培育3天從1.7倍增到3.3倍）方面起關(guān)鍵作用，為組織/器官生物制造提供了重要支撐。

正文
增材制造技術(shù)的發(fā)展使得利用細(xì)胞和生物材料制造用于各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的體外培養(yǎng)仿生器官成為可能，基于噴墨技術(shù)的生物打印可利用適用于大多數(shù)活細(xì)胞的噴嘴尺寸和打印分辨率，獲得高打印細(xì)胞存活率（＞90%），同時其非接觸打印、快速固化、高精度和自由曲面制造能力可用于制造復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)，如皮膚、組織和血管模型。然而，墨水中細(xì)胞沉降及其聚集現(xiàn)象導(dǎo)致液滴不穩(wěn)定、噴嘴堵塞和打印分布不均一，嚴(yán)重影響打印的準(zhǔn)確度，因此，本文重點研究了生物打印中有/無生物墨水循環(huán)對微球和片狀結(jié)構(gòu)中細(xì)胞分布的影響，揭示了細(xì)胞聚集對打印后細(xì)胞分布以及增殖和細(xì)胞活力的不利影響，為提高生物噴墨打印的精度和可靠性提供了重要的依據(jù)，這對組織/器官生物制造起著至關(guān)重要的作用。

▲ 圖1 帶有生物墨水儲液器的噴墨生物打印裝置示意圖

如圖1，使用MicroFab波形發(fā)生器連接MJ噴墨噴頭（120μm）并向其發(fā)送信號，以產(chǎn)生生物墨滴。通過連接在生物墨水儲液罐底部和頂部的生物用硅膠管控制墨水循環(huán)，流速0.3ml/min，維持細(xì)胞分布均勻。
 

▲ 圖2 （a）噴墨打印的液滴生成過程（b）微球包載單個細(xì)胞、小細(xì)胞聚集體和大細(xì)胞聚集體圖，比例尺40μm

圖2展示了液滴生成過程及打印結(jié)果的代表圖像，噴墨頻率、噴墨噴嘴的移動速度和移動偏移之間進行交叉優(yōu)化，以打印最佳的生物膜層。采用100Hz的噴墨頻率、200mm/min的移動速度和100μm的移動偏移來實現(xiàn)生物打印微球和生物打印線條之間的最佳融合。

▲ 圖3 在0.5%（w/v）NaAlg和1×106個細(xì)胞/ml的微球內(nèi)細(xì)胞分布和細(xì)胞聚集：（a）代表性圖像，（b）細(xì)胞分布，以及（c）細(xì)胞聚集。比例尺：100μm

圖3結(jié)果證明，有墨水循環(huán)系統(tǒng)時，生物打印微球內(nèi)細(xì)胞分布的均勻性得到改善，如圖3（a）所示，當(dāng)無墨水循環(huán)時，微球的平均細(xì)胞數(shù)增加到0.806，因為細(xì)胞會沉降從而導(dǎo)致局部細(xì)胞濃度和細(xì)胞聚集增加；當(dāng)引入墨水循環(huán)時，平均細(xì)胞數(shù)從 0.255略微增加到0.305，這表明噴墨打印微球內(nèi)細(xì)胞分布的均勻性得到了顯著改善。如圖4所示，當(dāng)細(xì)胞濃度高時（5×106個細(xì)胞/ml），引入生物墨水循環(huán)也能抑制細(xì)胞的聚集，應(yīng)用生物墨水循環(huán)來促進噴墨打印微球內(nèi)的細(xì)胞分布均勻性也適用于高細(xì)胞濃度。

▲ 圖4 在0.5%（w/v）NaAlg和5×106個細(xì)胞/ml的微球內(nèi)細(xì)胞分布和細(xì)胞聚集：（a）代表性圖像，（b）細(xì)胞分布，和（c）細(xì)胞聚集。比例尺：100μm

▲ 圖5 含有3T3小鼠成纖維細(xì)胞的生物打印片材內(nèi)細(xì)胞分布均勻性改善的結(jié)果：（a）生物打印片材（寬：0.5mm和高：1mm）和局部成像（比例尺：100μm）的代表性圖像及（b）統(tǒng)計結(jié)果

應(yīng)用生物墨水循環(huán)能提高生物打印片材內(nèi)細(xì)胞空間分布的均勻性，圖5（a）為生物打印片狀結(jié)構(gòu)中細(xì)胞分布的影響（隨機選擇面積為0.5×0.5mm的10個樣本）。圖 5（b）顯示了不同細(xì)胞濃度下生物打印片材的相應(yīng)細(xì)胞分布結(jié)果，當(dāng)無墨水循環(huán)時，低細(xì)胞濃度和高細(xì)胞濃度的高標(biāo)準(zhǔn)差反映了細(xì)胞聚集程度高、細(xì)胞分布不均勻，突出了解決細(xì)胞沉積和聚集問題的必要性。

▲ 圖6 孵育期有/無墨水循環(huán)對（a）細(xì)胞分布和（b）細(xì)胞活力的影響，（c）細(xì)胞縱橫比、（d）細(xì)胞分布比和（e）細(xì)胞活力的統(tǒng)計。比例尺：100μm

圖6展示了生物墨水循環(huán)對細(xì)胞分布及打印后細(xì)胞生長、增殖和活力的影響。均勻的細(xì)胞分布在細(xì)胞數(shù)量方面促進細(xì)胞增殖，在5×106個細(xì)胞濃度、20min生物墨水循環(huán)下，細(xì)胞孵育三天的活力從95%下降到92%，相比之下，無墨水循環(huán)的細(xì)胞活力從96%降到77%。細(xì)胞死亡通常發(fā)生在大細(xì)胞聚集體的中心周圍，可能是由于外層細(xì)胞過厚阻礙了營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換，因此細(xì)胞聚集體嚴(yán)重影響生物打印質(zhì)量，生物墨水循環(huán)及噴墨打印技術(shù)結(jié)合，制備均勻的片狀結(jié)構(gòu)，改善了細(xì)胞分布，促進細(xì)胞存活（培育3天從77%增到92%）和增殖（培育3天從1.7倍增到3.3倍）。

結(jié)語
本研究揭示了細(xì)胞聚集對噴墨生物打印中細(xì)胞分布及細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力的影響，并證實墨水循環(huán)系統(tǒng)可使細(xì)胞分布得到顯著改善，為提高噴墨生物打印技術(shù)的精度以及生物打印的活力提供了重要依據(jù)，這對組織/器官生物制造的成功起著至關(guān)重要的作用。

參考文獻(xiàn)：
[1] Liu J, Xu C. Improving uniformity of cell distribution in post-inkjet-based bioprinting[J]. Journal of Manufacturing Science and Engineering, 2024, 146(1): 014501.