CloudReady生物反應器助力進行大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)慢病毒載體四質(zhì)粒
引言
質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)依賴于基因重組技術，將目的基因和其他輔助元件連接形成共價閉合環(huán)狀結構，通過大腸桿菌高密度發(fā)酵、純化生產(chǎn)制備。隨著CGT和mRNA等生物制藥技術的飛速發(fā)展，質(zhì)粒DNA作為關鍵原料的需求急劇增加。
四質(zhì)粒系統(tǒng)是一種基于HIV-1病毒改造的慢病毒載體系統(tǒng)，由轉移質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒及Rev表達質(zhì)粒組成，各質(zhì)粒協(xié)同作用，共同完成假型慢病毒顆粒的包裝與感染過程。該系統(tǒng)在基因治療和臨床醫(yī)學研究中具有廣泛應用。
本研究在CloudReady®(1.5L) 4聯(lián)云平臺生物反應器中系統(tǒng)探究不同補料速度及方式對基于慢病毒載體的四質(zhì)粒系統(tǒng)在大腸桿菌上發(fā)酵生產(chǎn)質(zhì)粒DNA的影響，通過三種不同的補料方式，顯著提升了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率，為細胞與基因治療（CGT）及mRNA疫苗/藥物的產(chǎn)業(yè)化提供了重要技術支持。
材料與方法
實驗場所：
迪必爾生物 應用技術與工程研究中心（CARE）
菌株：
分別攜帶rev（4180bp）、fmc63(11922bp)、pol和gag（8890bp）、vsvg(5822bp)的四種大腸桿菌stbl3感受態(tài)細胞
檢測方法：
取發(fā)酵液100μL，經(jīng)離心去上清后，使用TIANGEN小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，并通過超微量分光光度計測定質(zhì)粒濃度。同時，采用實時熒光定量PCR儀檢測質(zhì)粒的完整性，確保無丟失現(xiàn)象發(fā)生（表1）。
反應器控制器及罐體：
CloudReady® + 1.5L 玻璃罐體×4
圖1 CloudReady云平臺生物反應器16聯(lián)
軟件系統(tǒng)：
D2MS(設備和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng), Device & Data management system）Pro
實驗過程及結果
本研究在實驗室成熟的發(fā)酵培養(yǎng)基配方基礎上進行，嚴格控制各項參數(shù)（如表2所示）。為了優(yōu)化質(zhì)粒產(chǎn)量，我們嘗試了三種不同的補料策略：補料關聯(lián)DO_PV、恒速補料和時間序列補料。
表2 控制參數(shù)
(1) 補料關聯(lián)DO_PV
實驗首先進行R1、R2的發(fā)酵實驗，按照補料泵關聯(lián)DO_PV值的方式進行補料（圖2），并且設置攪拌通氣只升不降。這種控制方式是根據(jù)DO_PV值的開關補料，具體邏輯是：DO_PV值高于設定的30%后，補料泵以10mL/h的速度運轉；DO_PV值低于設定的30%后，停止補料，這時溶氧控制器會調(diào)高攪拌速度、通氣量以增大DO。一般情況下，DO_PV值上升意味著底物的缺失，因此檢測DO_PV值的變化是可以較好的為菌株流加適量的底物。
然而這批實驗R1、R2在開啟補料后DO并未下降（圖3），反而是持續(xù)升高，導致補料泵持續(xù)運轉。推測可能是菌株在溶氧反彈后代謝發(fā)生變化，這時較快的補料速度反而可能有抑制作用。
圖2 補料關聯(lián)DO_PV
圖3 R1、R2溶氧曲線
(2) 恒速補料
上一批實驗溶氧未下降導致補料泵持續(xù)補料，這批實驗改用較慢的速度1mL/h恒速補料觀察菌株的生長狀況和質(zhì)粒產(chǎn)量。結果顯示（圖4），20.5h后四個菌株OD600沒有明顯上升，但質(zhì)粒產(chǎn)量有持續(xù)增長，且qPCR檢測質(zhì)粒無丟失現(xiàn)象；R2、R4在52h觀察到質(zhì)粒濃度下降的情況。
圖4 菌株OD600和質(zhì)粒濃度變化
(3) 時間序列補料
上批恒速補料菌株OD600沒有明顯增長，因此本批次增大補料速度，開啟補料后按補料開始的相對時間進行梯度補料（圖5）。圖6是此次實驗四個菌株OD600和質(zhì)粒濃度變化。本批次增大補料速度后四個菌株OD600和質(zhì)粒濃度都有持續(xù)升高，最終的菌株密度和質(zhì)粒產(chǎn)量也較上批恒速補料有所提高，且樣品QPCR檢測無丟失現(xiàn)象。批次運行46h下罐，培養(yǎng)過程中R1-R4的最大OD600分別為36.1、23.9、32、27.8，R1-R4的最大質(zhì)粒濃度分別為231.5、154、281.89、296.33mg/L，其中R2的最大OD600和質(zhì)粒濃度相比R1、R3、R4都是最低的，R1的最大OD600最高，R4的最大質(zhì)粒濃度最高。
圖6 菌株OD600和質(zhì)粒濃度變化
結論
本研究通過平行生物反應器平臺，系統(tǒng)地評估不同補料方式和速度在大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)質(zhì)粒DNA過程中的應用效果，發(fā)現(xiàn)補料速度較為合適的時間序列補料策略能夠有效提升質(zhì)粒DNA的產(chǎn)率和穩(wěn)定性。其中，攜帶vsvg的大腸桿菌在該策略下，最大質(zhì)粒濃度達到了296.33mg/L，這一結果充分驗證了該策略的有效性和可行性。本研究不僅為大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)質(zhì)粒DNA提供了重要的技術參考，同時也進一步驗證了平行生物反應器在發(fā)酵工藝優(yōu)化的重要性。
