肝臟DNA甲基化分析揭示表觀遺傳衰老對異生素代謝和轉運基因的影響
65+歲的老年人發生藥物不良反應（adverse drug reactions，ADR）的可能性是年輕人的7倍。隨著年齡增長，生理變化會損害身體安全處理藥物的能力，從而影響ADR風險。這些變化包括肝血流量減少、止血儲備下降和身體成分改變，這些都可能影響藥物吸收、分布、代謝和排泄（absorption, distribution, metabolism, and excretion，ADME）過程。然而，這些生理變化發生的時間和程度存在很大的個體差異，藥物反應與實際年齡沒有很好的相關性。因此，有必要更深入地了解影響ADME過程的與年齡相關的生理變化。
肝臟異生素代謝和轉運隨著年齡的增長而下降，而完整的異生素代謝與壽命有關。然而很少有研究分析表觀遺傳衰老對這些過程的全基因組范圍內的影響。本文利用簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）繪制了4月齡和24月齡小鼠肝臟的DNA甲基化變化，鑒定出數千個年齡相關差異甲基化位點（age-associated differentially methylated sites，a-DMS），其中許多位點與編碼I期和II期藥物代謝酶以及ABC和SLC類轉運蛋白的基因重疊。尤其Cyp1a2、Cyp2d9和Abcc2三個a-DMS顯著基因，分別編碼人類藥物代謝酶Cyp1a2和CYP2D6以及多藥耐藥蛋白2（MRP2）轉運蛋白的直系同源物。研究表明，隨著年齡的增長，Cyp2d9高甲基化與基因表達降低顯著相關，而Abcc2表達隨著年齡增長沒有變化。Cyp1a2隨著年齡增長而丟失甲基化，其表達也隨著年齡增長而降低。研究還假設了年齡相關的低甲基化，但與年齡相關的肝臟轉錄機制失調導致基因下調。通過對樣品中低甲基化a-DMS進行生物信息學分析，結果表明這些位點在肝細胞核因子4α（HNF4α）結合位點高度富集。HNF4α促進Cyp1a2表達，并隨年齡增長而下調，這可以解釋Cyp1a2表達的降低。總體而言，本研究支持表觀遺傳衰老對異生素代謝和轉運的廣泛影響。未來的工作應該評估肝細胞核受體功能與表觀遺傳衰老之間的相互作用。這些結果可能對長壽和健康衰老研究具有重要意義。
材料方法：
研究結果：
（1）測序數據統計、質控和整體甲基化水平
本研究通過簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）技術，成功地對小鼠肝臟組織樣本進行測序。每個樣本平均產生32.9M序列read（范圍在25.1M~38.9M），這些reads與mm10基因組的比對情況良好，符合RRBS預期參數（平均比對率71.1%，范圍在68.6%~76.9%之間）。非CpG甲基化百分比在0.4%~0.8%之間，表明亞硫酸鹽轉化效果良好。CpG背景下胞嘧啶的整體甲基化平均水平在4月齡小鼠中為34.3%，而在24月齡小鼠中為33.6%，表明隨著年齡增長，基因組整體呈現一定的低甲基化趨勢。
（2）年齡相關差異甲基化位點 （a-DMS） 的全基因組分析
通過RRBS DNA甲基化數據分析，研究人員利用主成分分析（PCA）對樣本進行了降維處理，并根據相關性和Ward聚類方法對樣本進行了聚類分析。圖1展示了樣本在前兩個主成分（PC1和PC2）上的載荷分布，而圖2則根據樣本間的相關性進行了聚類分析。
在圖1中，PC1和PC2能夠很好地區分年輕（4月齡）和老年（24月齡）小鼠的樣本。表明盡管樣本之間存在一定的變異性，但年齡相關的甲基化模式在整體上可以區分。PC1和PC2的主成分分析結果揭示了樣本間甲基化水平的顯著差異，這些差異可能與年齡相關的生物學過程有關。
圖2中的聚類分析進一步證實了這一點，通過Ward聚類方法，樣本根據甲基化模式分為兩組，分別對應于年輕和老年小鼠。聚類結果表明，盡管存在個體差異，但年齡相關的甲基化變化在小鼠群體中是一致的，并且可以用來區分不同年齡的樣本。
這些結果表明，RRBS技術能夠有效地捕捉到與年齡相關的DNA甲基化變化，并且這些變化可以通過PCA和聚類分析得到清晰的可視化。
圖1：基于相關性和Ward聚類方法（來自MethyKit的分析），在RRBS DNA甲基化數據的前兩個主成分上繪制了樣本載荷圖，并對樣本進行了B聚類
圖2：4月齡和24月齡小鼠肝臟中與年齡相關的差異甲基化位點的火山圖。y軸是p值的負對數，x軸表示甲基化隨年齡的變化。全基因組顯著性由小于5%（水平虛線）的錯誤發現率（FDR）決定。垂直虛線顯示隨著年齡的增長，>10%高甲基化和 >10%低甲基化。全基因組顯著位點顯示隨著年齡增長，＞10%高甲基化為紅色，>10%低甲基化為藍色。顯示了與前5個高甲基化和低甲基化位點相關基因，以及頂級異生代謝基因和轉運蛋白
（3）與雌性小鼠中的a-DMS整合分析
表1：雄性小鼠肝臟中年齡相關差異甲基化位點（a-DMS）與雌性小鼠肝臟中已發表的a-DMS重疊
（4）異生素代謝基因與顯著的a-DMS相關
圖3：年齡相關差異甲基化位點（a-DMS）的基因本體論（GO）富集分析表明，＞10%的高甲基化或低甲基化基因涉及生物學過程。最豐富的生物學過程按照統計顯著性遞減的順序顯示。使用GREAT（Genomic Regions of Enrichment Annotation Tool）工具進行分析和繪圖，揭示了與年齡相關的甲基化變化最顯著的基因主要參與的生物學過程。
（5）a-DMS與年齡相關的基因表達變化的整合
從獲得RRBS數據的相同生物材料中提取RNA，并使用qPCR檢測Cyp1a2、Cyp2d9和Abcc2的表達水平。
研究人員探討了Cyp2d9、Cyp1a2和Abcc2這三個基因隨著年齡增長在DNA甲基化和表達水平上的變化。通過RRBS數據分析，研究顯示Cyp2d9基因隨著年齡的增長出現了甲基化水平增加（hypermethylation），而Cyp1a2和Abcc2則表現出甲基化水平降低（hypomethylation）。
在基因表達水平方面，與4月齡小鼠相比，Cyp2d9和Cyp1a2這兩個基因在24月齡小鼠中表達水平降低，而Abcc2基因的表達水平在年齡增長過程中沒有顯著差異。
此外，研究還分析了甲基化水平與基因表達之間的關系。Cyp2d9甲基化水平的增加與基因表達水平的降低之間存在顯著的負相關關系。表明隨著年齡的增長，Cyp2d9甲基化水平增加可能導致其表達水平的降低。然而，對于Cyp1a2和Abcc2，甲基化水平的變化與基因表達水平之間沒有顯著的關聯。這可能意味著除了DNA甲基化之外，還有其他因素影響這些基因的表達。
圖4：Cyp2d9、Cyp1a2和Abcc2的DNA甲基化和表達隨年齡而變化。
A、D、G：三個位點DNA甲基化隨年齡變化最顯著，Cyp2d9隨著年齡增長而顯示高甲基化，而Cyp1a2和Abcc2隨著年齡增長而顯示低甲基化（來自RRBS的數據）。
B、E、H：RNA隨年齡變化的相對定量，其中4月齡小鼠樣本設置為平均值=1.0。隨著年齡增長，兩種Cyp基因的基因表達均較低，而Abcc2表達隨年齡的增長無顯著差異。
C、F、I：甲基化水平與基因表達之間的相關性。Cyp2d9的兩個變量之間存在顯著的負相關關系，而Cyp1a2和Abcc2的DNA甲基化變化與年齡和表達之間沒有顯著關聯。（n=每個年齡組6只小鼠）
（6）結果的驗證和重復
通過使用高分辨率熔解（HRM）技術分析亞硫酸鹽轉化后的DNA，研究人員對Cyp2d9和Cyp1a2基因隨年齡增長在DNA甲基化和表達變化的實驗進行重復。這些結果在一個獨立的雄性小鼠樣本集中得到了驗證，每個年齡組（4月齡和24月齡）都有6只小鼠。
圖5：Cyp2d9和Cyp1a2的DNA甲基化和表達年齡相關變化的重復。
A、D：顯示了在一個獨立的雄性受試者樣本（每個年齡組n=6），使用靶向技術，對亞硫酸氫鹽轉化的DNA進行高分辨率熔解（HRM）分析。展示了在Cyp2d9和Cyp1a2基因的最顯著差異甲基化位點（a-DMS）上，隨著年齡的增長，DNA甲基化的變化情況。對于Cyp2d9，結果顯示隨著年齡的增長，DNA甲基化水平增加，而對于Cyp1a2，甲基化水平則呈現降低趨勢。
B、E：分別顯示了重復樣品中Cyp2d9和Cyp1a2的基因表達隨年齡的變化。Cyp2d9隨著年齡的增長，基因表達水平降低，這與甲基化水平增加有關。
C：Cyp2d9 DNA甲基化與表達呈顯著負相關，DNA甲基化增加導致表達減少。（每個年齡組n=12）。Cyp2d9的DNA甲基化和表達之間存在顯著的負相關關系。這意味著隨著甲基化水平的增加，Cyp2d9的表達水平降低。
F：在合并的發現和重復樣本中，Cyp1a2甲基化與表達水平之間沒有顯著的相關性，表明Cyp1a2基因的表達降低可能受到除DNA甲基化之外的其他因素的影響。
（7）DNA甲基化衰老對Cyp1a2表達的遠端影響
研究人員探討了隨著年齡增長，DNA甲基化衰老對Cyp1a2基因表達的遠端效應。研究人員提出了假設，即遠端（長遠）高甲基化差異甲基化位點（a-DMS）可能會影響Cyp1a2表達降低。為了驗證這一假設，研究人員分析了整個基因組中所有a-DMS的甲基化水平與Cyp1a2表達之間的關聯。
通過多重假設檢驗校正（False Discovery Rate, FDR < 0.05），研究人員發現沒有任何a-DMS與Cyp1a2表達顯示出足夠強的關聯性。這意味著在他們的RRBS數據捕獲的任何位點上，遠端a-DMS不太可能是導致Cyp1a2基因表達隨年齡增長而降低的主要原因。
（8）低甲基化a-DMS的位點重疊分析
表2：低甲基化a-DMS肝臟轉錄因子結合位點的富集
參考文獻：
Abudahab S, Kronfol MM, Dozmorov MG, Campbell T, Jahr FM, Nguyen J, AlAzzeh O, Al Saeedy DY, Victor A, Lee S, Malay S, Lapato DM, Halquist MS, McRae M, Deshpande LS, Slattum PW, Price ET, McClay JL. Genome-wide analysis of hepatic DNA methylation reveals impact of epigenetic aging on xenobiotic metabolism and transport genes in an aged mouse model. Geroscience. 2024 Apr 1.
肝臟異生素代謝和轉運隨著年齡的增長而下降，而完整的異生素代謝與壽命有關。然而很少有研究分析表觀遺傳衰老對這些過程的全基因組范圍內的影響。本文利用簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）繪制了4月齡和24月齡小鼠肝臟的DNA甲基化變化，鑒定出數千個年齡相關差異甲基化位點（age-associated differentially methylated sites，a-DMS），其中許多位點與編碼I期和II期藥物代謝酶以及ABC和SLC類轉運蛋白的基因重疊。尤其Cyp1a2、Cyp2d9和Abcc2三個a-DMS顯著基因，分別編碼人類藥物代謝酶Cyp1a2和CYP2D6以及多藥耐藥蛋白2（MRP2）轉運蛋白的直系同源物。研究表明，隨著年齡的增長，Cyp2d9高甲基化與基因表達降低顯著相關，而Abcc2表達隨著年齡增長沒有變化。Cyp1a2隨著年齡增長而丟失甲基化，其表達也隨著年齡增長而降低。研究還假設了年齡相關的低甲基化，但與年齡相關的肝臟轉錄機制失調導致基因下調。通過對樣品中低甲基化a-DMS進行生物信息學分析，結果表明這些位點在肝細胞核因子4α（HNF4α）結合位點高度富集。HNF4α促進Cyp1a2表達，并隨年齡增長而下調，這可以解釋Cyp1a2表達的降低。總體而言，本研究支持表觀遺傳衰老對異生素代謝和轉運的廣泛影響。未來的工作應該評估肝細胞核受體功能與表觀遺傳衰老之間的相互作用。這些結果可能對長壽和健康衰老研究具有重要意義。
材料方法：
研究結果：（1）測序數據統計、質控和整體甲基化水平
本研究通過簡化基因組亞硫酸鹽測序（RRBS）技術，成功地對小鼠肝臟組織樣本進行測序。每個樣本平均產生32.9M序列read（范圍在25.1M~38.9M），這些reads與mm10基因組的比對情況良好，符合RRBS預期參數（平均比對率71.1%，范圍在68.6%~76.9%之間）。非CpG甲基化百分比在0.4%~0.8%之間，表明亞硫酸鹽轉化效果良好。CpG背景下胞嘧啶的整體甲基化平均水平在4月齡小鼠中為34.3%，而在24月齡小鼠中為33.6%，表明隨著年齡增長，基因組整體呈現一定的低甲基化趨勢。
（2）年齡相關差異甲基化位點 （a-DMS） 的全基因組分析
通過RRBS DNA甲基化數據分析，研究人員利用主成分分析（PCA）對樣本進行了降維處理，并根據相關性和Ward聚類方法對樣本進行了聚類分析。圖1展示了樣本在前兩個主成分（PC1和PC2）上的載荷分布，而圖2則根據樣本間的相關性進行了聚類分析。
在圖1中，PC1和PC2能夠很好地區分年輕（4月齡）和老年（24月齡）小鼠的樣本。表明盡管樣本之間存在一定的變異性，但年齡相關的甲基化模式在整體上可以區分。PC1和PC2的主成分分析結果揭示了樣本間甲基化水平的顯著差異，這些差異可能與年齡相關的生物學過程有關。
圖2中的聚類分析進一步證實了這一點，通過Ward聚類方法，樣本根據甲基化模式分為兩組，分別對應于年輕和老年小鼠。聚類結果表明，盡管存在個體差異，但年齡相關的甲基化變化在小鼠群體中是一致的，并且可以用來區分不同年齡的樣本。
這些結果表明，RRBS技術能夠有效地捕捉到與年齡相關的DNA甲基化變化，并且這些變化可以通過PCA和聚類分析得到清晰的可視化。
圖1：基于相關性和Ward聚類方法（來自MethyKit的分析），在RRBS DNA甲基化數據的前兩個主成分上繪制了樣本載荷圖，并對樣本進行了B聚類
圖2：4月齡和24月齡小鼠肝臟中與年齡相關的差異甲基化位點的火山圖。y軸是p值的負對數，x軸表示甲基化隨年齡的變化。全基因組顯著性由小于5%（水平虛線）的錯誤發現率（FDR）決定。垂直虛線顯示隨著年齡的增長，>10%高甲基化和 >10%低甲基化。全基因組顯著位點顯示隨著年齡增長，＞10%高甲基化為紅色，>10%低甲基化為藍色。顯示了與前5個高甲基化和低甲基化位點相關基因，以及頂級異生代謝基因和轉運蛋白
（3）與雌性小鼠中的a-DMS整合分析
表1：雄性小鼠肝臟中年齡相關差異甲基化位點（a-DMS）與雌性小鼠肝臟中已發表的a-DMS重疊（4）異生素代謝基因與顯著的a-DMS相關
圖3：年齡相關差異甲基化位點（a-DMS）的基因本體論（GO）富集分析表明，＞10%的高甲基化或低甲基化基因涉及生物學過程。最豐富的生物學過程按照統計顯著性遞減的順序顯示。使用GREAT（Genomic Regions of Enrichment Annotation Tool）工具進行分析和繪圖，揭示了與年齡相關的甲基化變化最顯著的基因主要參與的生物學過程。（5）a-DMS與年齡相關的基因表達變化的整合
從獲得RRBS數據的相同生物材料中提取RNA，并使用qPCR檢測Cyp1a2、Cyp2d9和Abcc2的表達水平。
研究人員探討了Cyp2d9、Cyp1a2和Abcc2這三個基因隨著年齡增長在DNA甲基化和表達水平上的變化。通過RRBS數據分析，研究顯示Cyp2d9基因隨著年齡的增長出現了甲基化水平增加（hypermethylation），而Cyp1a2和Abcc2則表現出甲基化水平降低（hypomethylation）。
在基因表達水平方面，與4月齡小鼠相比，Cyp2d9和Cyp1a2這兩個基因在24月齡小鼠中表達水平降低，而Abcc2基因的表達水平在年齡增長過程中沒有顯著差異。
此外，研究還分析了甲基化水平與基因表達之間的關系。Cyp2d9甲基化水平的增加與基因表達水平的降低之間存在顯著的負相關關系。表明隨著年齡的增長，Cyp2d9甲基化水平增加可能導致其表達水平的降低。然而，對于Cyp1a2和Abcc2，甲基化水平的變化與基因表達水平之間沒有顯著的關聯。這可能意味著除了DNA甲基化之外，還有其他因素影響這些基因的表達。
圖4：Cyp2d9、Cyp1a2和Abcc2的DNA甲基化和表達隨年齡而變化。A、D、G：三個位點DNA甲基化隨年齡變化最顯著，Cyp2d9隨著年齡增長而顯示高甲基化，而Cyp1a2和Abcc2隨著年齡增長而顯示低甲基化（來自RRBS的數據）。
B、E、H：RNA隨年齡變化的相對定量，其中4月齡小鼠樣本設置為平均值=1.0。隨著年齡增長，兩種Cyp基因的基因表達均較低，而Abcc2表達隨年齡的增長無顯著差異。
C、F、I：甲基化水平與基因表達之間的相關性。Cyp2d9的兩個變量之間存在顯著的負相關關系，而Cyp1a2和Abcc2的DNA甲基化變化與年齡和表達之間沒有顯著關聯。（n=每個年齡組6只小鼠）
（6）結果的驗證和重復
通過使用高分辨率熔解（HRM）技術分析亞硫酸鹽轉化后的DNA，研究人員對Cyp2d9和Cyp1a2基因隨年齡增長在DNA甲基化和表達變化的實驗進行重復。這些結果在一個獨立的雄性小鼠樣本集中得到了驗證，每個年齡組（4月齡和24月齡）都有6只小鼠。
圖5：Cyp2d9和Cyp1a2的DNA甲基化和表達年齡相關變化的重復。
A、D：顯示了在一個獨立的雄性受試者樣本（每個年齡組n=6），使用靶向技術，對亞硫酸氫鹽轉化的DNA進行高分辨率熔解（HRM）分析。展示了在Cyp2d9和Cyp1a2基因的最顯著差異甲基化位點（a-DMS）上，隨著年齡的增長，DNA甲基化的變化情況。對于Cyp2d9，結果顯示隨著年齡的增長，DNA甲基化水平增加，而對于Cyp1a2，甲基化水平則呈現降低趨勢。
B、E：分別顯示了重復樣品中Cyp2d9和Cyp1a2的基因表達隨年齡的變化。Cyp2d9隨著年齡的增長，基因表達水平降低，這與甲基化水平增加有關。
C：Cyp2d9 DNA甲基化與表達呈顯著負相關，DNA甲基化增加導致表達減少。（每個年齡組n=12）。Cyp2d9的DNA甲基化和表達之間存在顯著的負相關關系。這意味著隨著甲基化水平的增加，Cyp2d9的表達水平降低。
F：在合并的發現和重復樣本中，Cyp1a2甲基化與表達水平之間沒有顯著的相關性，表明Cyp1a2基因的表達降低可能受到除DNA甲基化之外的其他因素的影響。
（7）DNA甲基化衰老對Cyp1a2表達的遠端影響
研究人員探討了隨著年齡增長，DNA甲基化衰老對Cyp1a2基因表達的遠端效應。研究人員提出了假設，即遠端（長遠）高甲基化差異甲基化位點（a-DMS）可能會影響Cyp1a2表達降低。為了驗證這一假設，研究人員分析了整個基因組中所有a-DMS的甲基化水平與Cyp1a2表達之間的關聯。
通過多重假設檢驗校正（False Discovery Rate, FDR < 0.05），研究人員發現沒有任何a-DMS與Cyp1a2表達顯示出足夠強的關聯性。這意味著在他們的RRBS數據捕獲的任何位點上，遠端a-DMS不太可能是導致Cyp1a2基因表達隨年齡增長而降低的主要原因。
（8）低甲基化a-DMS的位點重疊分析
表2：低甲基化a-DMS肝臟轉錄因子結合位點的富集參考文獻：
Abudahab S, Kronfol MM, Dozmorov MG, Campbell T, Jahr FM, Nguyen J, AlAzzeh O, Al Saeedy DY, Victor A, Lee S, Malay S, Lapato DM, Halquist MS, McRae M, Deshpande LS, Slattum PW, Price ET, McClay JL. Genome-wide analysis of hepatic DNA methylation reveals impact of epigenetic aging on xenobiotic metabolism and transport genes in an aged mouse model. Geroscience. 2024 Apr 1.
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