對于做過分子實驗的小伙伴來說，傳統的分子克隆技術——酶切連接，大家應該都是比較熟悉的，那么對于其他的分子克隆技術類型大家有了解過嗎？根據不同的實驗需求，來選擇不同的分子克隆技術以及產品。本期，小愛帶大家一起來了解下幾種常規的分子克隆技術吧。
 

酶切連接法屬于經典的分子克隆方法，利用限制性內切酶切割DNA和利用DNA連接酶連接DNA，最后轉化篩選及純化，完成重組基因的大量制備。

圖1 酶切連接流程
 

成功的酶切和有效的連接是分子克隆實驗圓滿完成的必要條件。限制性內切酶能特異性地結合于能被限制性內切酶識別的DNA序列之內或其附近的特異性位點上，并切割雙鏈DNA。根據限制酶的識別切割特性、催化條件以及是否有修飾酶活性，可分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。分子克隆技術中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。

粘性末端，即限制性內切酶在DNA雙鏈上交錯切割，形成的核苷酸順序互補的，可形成氫鍵的末端（見圖2）。

平齊末端，限制性內切酶在DNA雙鏈的相同位置切割DNA分子，這樣形式的斷裂是形成具有平末端的DNA片斷（見圖3）。

圖2 EcoR I切割DNA形成粘性末端DNA片段

圖3 AluI切割DNA形成平末端DNA片段

核酸片段可以通過連接酶的作用連接起來而獲得重組分子。DNA接酶催化雙鏈DNA子中相鄰堿基的5’-P末端與3-0H間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶——T4 DNA Ligase，被稱為生物界的“502”。在有Mg2+和ATP存在的條件下，T4 DNA Ligase能催化雙鏈DNA或RNA上相鄰的5´-磷酸末端和3´-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化雙鏈DNA的平末端或粘性末端之間的連接，還可以修復雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA雜交雙鏈中的單鏈切刻，但不能催化單鏈DNA之間的連接。

圖4 T4 DNA連接酶作用位點
 

TA克隆是指把PCR片段與一個具有3‘-T突出的載體DNA連接起來的方法。可用于不清楚目的基因的DNA序列，獲得的目的片段通常需要通過TA克隆的方法重組到T-載體中，通過測序測定DNA序列。Absin T-Vector快速克隆試劑盒是高效、便利的PCR產物克隆專用試劑盒。

圖5 TA克隆流程
 

無縫克隆技術是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，可以在質粒的任何位點進行一個或多個目標DNA的片斷的插入，而不需要任何限制性內切酶和連接酶，只需要一步重組法，即可得到高效率克隆的重組載體，大大提高了工作效率。Absin快速多片段DNA組裝預混液(abs60250)就是基于重組原理的無縫克隆技術，它不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據DNA片段與線性化載體末端的15~25nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術。

圖6 Absin快速多片段DNA組裝預混液（abs60250）無縫克隆操作流程
 

TOPO克隆實際是基于拓撲異構酶的克隆技術，關鍵是拓撲異構酶。該技術不需要限制性內切酶或外源連接酶，從而提供了將新的PCR產物克隆到質粒中的極其簡便快捷的方法。
 

Geteway克隆利用位點特異重組實現目的片段的插入的，載體上的一段目的片段在重組酶的作用下會替換成目的片段，不依賴限制性內切酶和連接酶，導入目的基因不需要開環處理，載體需要用試劑盒提供的載體，一般需要用到兩個載體，快速、高效將DNA序列轉移到載體上的克隆。