基因分型在動物、植物、微生物的物種、菌種篩查、篩選、缺陷、突變基因的檢測，根據(jù)個體基因類型實現(xiàn)對諸如癌癥治療、監(jiān)測等的精準用藥，以及消費類基因檢測如酒精代謝能力基因檢測等等領(lǐng)域有很多應(yīng)用。

  通常，基因分型SNP采用熒光探針終點法，檢測一個位點需要兩個熒光探針，如一個探針的熒光報告基團用FAM通道，另一個用HEX(VIC)通道來檢測。由于合成PCR熒光探針的成本較高，為降低成本，可以采用較小的反應(yīng)體系，如在384孔熒光定量PCR儀上使用5uL的反應(yīng)體系。對于一些非臨床及消費類、或者需要檢測幾十個位點以上、對成本敏感的基因分型檢測應(yīng)用項目，可以考慮使用飽和染料的高分辨熔解曲線法HRM（High Resolution Melting Curve分辨率優(yōu)于0.1°C），如果不包括核酸提取的費用，與探針法比，成本可降低10倍，甚至100倍。 HRM法為了能夠在熔化溫度Tm上區(qū)分出只差一個堿基的兩個DNA片段，在保證特異性的前提下，選擇被擴增的DNA片段的長度越短越好，因此，除了引物的設(shè)計有擴增片段短的特殊要求外，對熒光定量PCR儀的HRM性能及擴增的準確性能則有很高的要求。以下幾點是保證HRM實現(xiàn)正確、可靠的基因分型的關(guān)鍵。

  首先，HRM的分辨率最好優(yōu)于0.05°C，一般，只有采用熒光成像技術(shù)的QPCR儀，因為同時采集所有樣品孔的信號才能勝任，而采用掃描技術(shù)的儀器完成一次全板掃描一般需要5秒以上，也就是說第一個孔和最后一個孔的檢測時間差為5秒以上，熔化過程中溫度是連續(xù)變化的，這將導(dǎo)致每次檢測各孔上的溫度的不一致，因此，掃描式的QPCR儀一般不適合做HRM。

  第二，為了用只生成小于100bp擴增產(chǎn)物的引物，有時可能無法很好地兼顧特異性，又由于HRM染料法本身特異性就較弱，這就給熒光定量PCR實驗帶來易發(fā)生非特異性的壓力，除了需要選用擴增特異性好的QPCR Master Mix外，還需要先用梯度QPCR預(yù)實驗來優(yōu)化退火溫度，找到該引物的最佳退火溫度后，再使用Touchdown PCR 或稱TD PCR來有效地控制非特異性擴增。Stepdown PCR也能夠抑制非特異性擴增，但抑制效果較Touchdown PCR弱一些。

  第三， 如果需要區(qū)分兩個純合子的Tm差較小時，例如當(dāng)兩個純合子的Tm差只有0.5°C時，它們對應(yīng)的雜合子就可能難以單純依靠Tm與兩個純合子區(qū)分開來，這時，我們可以引入熔解曲線的Tm峰寬因子或峰的線型來判斷雜合子。

   圖一為在福生生物的FS384 QPCR儀上使用5uL反應(yīng)體系的FAM和VIC兩種探針的終點法檢測一個位點的384個樣品的SNP分型結(jié)果。

 
  圖二為在福生生物的FS384 QPCR儀上用Touchdown PCR方法來擴增，接著用高分辨率0.02°C 的HRM實現(xiàn)低成本的基因分型，圖中左下角的表列出了所有樣品孔，根據(jù)Tm值及其峰寬值正確判斷出每個樣品的分型結(jié)果。在這個實驗中，兩個純合子的峰寬都小于1.5°C，而雜合子的峰寬在2°C左右。