世界首篇非洲爪蟾環狀RNA研究成果發表！

瀏覽次數：4185　發布日期：2018-3-16　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

作為最新的明星分子，環狀RNA的熱度與日俱增。環狀RNA到底火到了什么程度？從云序客戶捷報頻傳﹑研究成果不斷就可見一斑：上期我們剛剛介紹云序客戶發表了世界首個小鼠腦創傷模型外泌體環狀RNA的研究，整合了外泌體和環狀RNA兩大科研熱點。在探索新物種的環狀RNA研究上，云序客戶此前更是先后發表了全世界第一篇斑馬魚環狀RNA、第一篇小麥環狀RNA和第一篇雞環狀RNA文章，如今首篇非洲爪蟾的環狀RNA文章新鮮出爐了！這一成果今年年初發表在《Chemosphere》（影響因子4.2）上！

研究背景：

利用高通量測序手段，研究者們在擬南芥、小鼠、果蠅和人體內都發現了環狀RNA的高度表達，證明了環狀RNA在不同物種中廣泛存在。目前，已經進行過環狀RNA研究的物種數量還非常有限，環狀RNA數據庫circBase中已收錄的物種僅有7個。作為一種重要的模式生物，非洲爪蟾的環狀RNA尚未見報道。本文通過云序生物提供的一站式環狀RNA測序、環狀RNA定量PCR、環狀RNA的RNase R耐受性實驗和生物信息學服務于全世界首次進行了非洲爪蟾環狀RNA表達譜的構建，為后續研究脊椎動物環狀RNA的生物學功能奠定了基礎，非常具有借鑒意義。

研究思路：

作者首先分離了采用除草劑處理的雄性非洲爪蟾的睪丸組織，提取RNA，通過全轉錄組測序檢測樣本中環狀RNA的表達變化。結果發現405個差異表達的環狀RNA，其中44條上調和361條下調，這暗示著這些環狀RNA可能在AZ污染過程中發揮作用。接下來通過環狀RNA定量PCR檢測和RNase R耐受性實驗驗證了環狀RNA的表達量和結構。隨后通過生信分析如GO及KEGG分析對差異表達的環狀RNA進行了功能預測。GO分析表明這些RNA分子主要參與19條信號通路，其中Wnt信號通路和黃體酮介導的卵母細胞成熟通路可能是AZ污染涉及的信號通路。CircRNA-miRNA互作網絡圖揭示了環狀RNA作用靶miRNA及可能的功能。本文首次研究了非洲爪蟾的環狀RNA表達譜，為后續分子機理詳細研究提供諸多靶分子。

研究路線圖：

1.環狀RNA測序，高通量篩選AZ處理相關環狀RNA

各類農藥(除草劑、殺蟲劑和殺菌劑三類)對非洲爪蟾產生的包括神經發育、性腺發育和變態發育等方面的毒害作用,使得非洲爪蟾作為農藥污染監測的模式生物備受青睞。莠去津（Atrazine, AZ）是地下水和地表水中最常見的環境內分泌干擾物之一。研究人員在Nieuwkoop-Faber（NF）第47階段（孵化后第13天），將來自一對成年配偶的蝌蚪隨機分為AZ處理和對照兩組，隨后收集雄性非洲爪蟾的睪丸組織（AZ處理組vs.對照組：3 vs.3）用于檢測非洲爪蟾中所有環狀RNA的表達情況，檢測一共發現了68575條環狀RNA。接下來，研究人員系統分析了不同樣本之間環狀RNA的表達情況，發現405條環狀RNA差異表達（包括44條上調和361條下調），這暗示著這些環狀RNA可能在AZ污染過程中發揮作用。

圖注：不同樣本之間差異表達的環狀RNA

2. 環狀RNA定量PCR及RNase R耐受實驗，驗證環狀RNA的表達和結構

為了驗證測序結果的準確性，研究人員隨機選取了8條差異表達的環狀RNA，利用“divergent primers”進行環狀RNA定量PCR檢測和RNase R耐受性實驗。所有環狀RNA的表達都能夠被定量PCR實驗檢測到，并且定量PCR結果與測序結果趨勢一致，表明環狀RNA測序結果準確性非常高。所有環狀RNA都能抵抗RNase R的消化，進一步證實了這些RNA的環形結構。

圖注：差異表達環狀RNA的定量PCR驗證。左：引物位置圖；右：RNase R耐受性實驗結果

3.生物信息學分析，AZ處理相關環狀RNA的功能預測

2013年兩篇Nature文章揭示環狀RNA具有miRNA海綿的功能，它可以吸附miRNA來調節相關基因的表達。此后，環狀RNA的ceRNA功能機制正被人們廣泛研究。研究人員通過生物信息學預測，發現282條AZ相關差異表達的環狀RNA含有miRNA的結合位點，每個環狀RNA的結合位點數從1到21不等。基于這些數據，研究人員根據它們的結合能力選出了5個miRNA。然后他們隨機選擇了5個差異下調的環狀RNA，并使用前5個預測的miRNA構建了circRNA-miRNA網絡。可以看出每個環狀RNA有多個miRNA結合位點，且一些環狀RNA與同一miRNA的結合位點是相同的，暗示著環狀RNA彼此之間的競爭性與miRNA結合。以上結果表明非洲爪蟾體內環狀RNA可能存在的miRNA的海綿功能。

圖注：依據AZ處理組5條差異下調的環狀RNA建立的circRNA-miRNA網絡圖

此外研究人員在以上基礎上進一步預測了這282條差異表達的環狀RNA結合miRNA的靶基因功能。通過GO分析和KEGG 信號通路分析，發現這些miRNA的靶基因主要參與了19條信號通路，其中Wnt信號通路和黃體酮介導的卵母細胞成熟通路可能是AZ污染涉及的信號通路。

圖注：差異表達的環狀RNA來源基因KEGG分析

結語： 作為一種廣泛存在于各類真核生物中的新型非編碼RNA，環狀RNA逐漸成為了當下最熱門的明星分子。由于環狀RNA的研究剛剛起步，已經進行過環狀RNA研究的物種數量還非常有限。因此，對新物種中環狀RNA表達譜進行系統性研究就成為了發表SCI文章的一條捷徑。云序生物客戶發表的這項成果是全世界第一篇對非洲爪蟾環狀RNA進行系統性研究的文章，也為廣大研究人員提供了一個非常好的模板，即：如何通過環狀RNA高通量測序和生物信息學分析，在不進行功能和分子機制研究的情況下，短平快的發表一篇影響因子不錯的文章，非常具有借鑒意義。

參考文獻：

Identification of circular RNAs and their alterations involved in developing male Xenopus laevis chronically exposed to atrazine

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