當(dāng)western blot進行定量時，許多人認為只需將感興趣的蛋白質(zhì)成像，剝離，重孵育內(nèi)參蛋白，然后將其用于歸一化，而不考慮線性范圍的檢測。 然而，與此有關(guān)的幾個誤區(qū)，越來越多的期刊現(xiàn)在要求一個適當(dāng)?shù)亩�義的標(biāo)準(zhǔn)化流程，包括線性檢測的證明，還包括所有草稿。

線性檢測是條帶強度與膜上目標(biāo)蛋白成比例的區(qū)域。 隨著蛋白量增加，條帶強度應(yīng)該增加。 在下面的圖片中，您可以看到問題在哪里，線性范圍標(biāo)有藍色框，在該區(qū)域之外，該比例關(guān)系丟失，特別是在信號完全過飽和或極低的表達量時。

蛋白質(zhì)印跡的定量在目標(biāo)蛋白和上樣對照兩者都具有相似的線性范圍的情況下，蛋白質(zhì)印跡定量才是真正準(zhǔn)確，因此，當(dāng)上樣質(zhì)控對照被考慮時，事情變得更復(fù)雜。 這在下面的兩張圖中顯示; 在第一個檢測線性范圍重疊的地方，蛋白質(zhì)在該重疊區(qū)域內(nèi)的定量將是很好的。 然而，在后者中，它們不重疊，容易看出蛋白質(zhì)濃度的變化如何影響一種蛋白條帶強度，而不影響另一種蛋白質(zhì)的條帶強度。 在這種情況下，定量是不準(zhǔn)確的。

確定線性范圍相對容易，可以通過樣品并進行連續(xù)稀釋來實現(xiàn)。 如果線性范圍重疊，則確定要加載的樣品量也同樣容易。 然而，如果范圍不重疊，如評估高表達的看家基因相關(guān)聯(lián)的低豐度蛋白是非常常見的，定量就變得很困難。 此外，如果你感興趣的蛋白被刺激上升或下調(diào)，那么這可能會進一步干擾您嘗試適應(yīng)線性范圍。

如果你的線性范圍不重疊，我們該怎么辦？

但是，有幾個辦法可用。 經(jīng)常被忽視的步驟是改變上樣質(zhì)控。 如果您知道您的蛋白質(zhì)表達水平相對較低，則上樣控制選擇如beta-actin蛋白可能不合適。 在這些情況下，使用細胞器特異性蛋白質(zhì)可能會更有益，如Lamin B1或HSP60，因為它們應(yīng)該表達不是特別高，但是應(yīng)注意確認這些蛋白是表達不會因為處理而發(fā)生改變

第二個選擇是從單一內(nèi)參上樣質(zhì)控轉(zhuǎn)向總蛋白定量，作為質(zhì)控的一種手段。 通過評估整個蛋白范圍，產(chǎn)生更廣泛的動態(tài)范圍。 這些染色包括凝膠和膜染色，并且可以以各種不同的方式成像。 此外，如前所述，該技術(shù)是檢查蛋白分離質(zhì)量和轉(zhuǎn)印效率非常好方法。

最后，可以在成像期間擴大動態(tài)范圍。 膠片動態(tài)范圍很差，曝光時間不準(zhǔn)確的問題可能會使事情變得更加復(fù)雜。 凝膠和膜在成像系統(tǒng)里面進行成像，如我們的c系列。 諸如c600的成像系統(tǒng)和Azure Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)能夠在更寬的動態(tài)范圍內(nèi)進行成像，因此能夠進行線性范圍的檢測。