染色質免疫沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，簡稱ChIP）是研究活體內蛋白質與DNA相互作用的一種技術。它利用抗原抗體反應的特異性，可以真實地反映體內蛋白因子與基因組DNA結合的狀況。隨著對基因功能研究的不斷深入，這項技術正越來越多的被應用于科研的各個領域。

ChIP的原理

  把生理狀態(tài)下的細胞內的DNA與蛋白質交聯(lián)在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來，然后可進行后續(xù)的DNA序列測序鑒定等。

ChIP實驗步驟

ChIP經驗分享

ChIP實驗操作性很強，金開瑞根據多年的實踐，總結了一些ChIP實驗中您可能會遇到的棘手的問題，下面我們就一起來分享一下吧！                                                 

細胞固定

1、甲醛終濃度為1%較適宜；

2、固定時間一般為5-60min較好，具體時間根據實驗而定。；

染色質斷裂

超聲時斷時續(xù)，保證低溫；
注意探頭位置，防止產生泡沫；
研究組蛋白需使用酶處理；

染色質免疫沉淀

最好有Input對照，Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果，還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗必不可少的步驟。

抗體的選擇是關鍵。抗體的選擇要注意三點：一是應該選擇能夠做ChIP實驗的抗體。盡量選擇ChIP級別商業(yè)化的抗體。如沒有，一般可以重組到帶有標簽的載體上，再轉染相應的宿主（目前市面上商業(yè)化的chip抗體只有300多種，因此正好找到對應抗體較困難，可以選擇標簽抗體）。二是抗體的結合位點。選擇單抗的話，盡量遠離抗原和染色質相結合的位點，這樣可以最大限度保證抗體和抗原的結合，而多抗可識別多個表位，可基本避免該風險。因此單多抗各有優(yōu)缺點，應重點關注該抗體是否經過ChIP驗證。三是抗體的濃度�？贵w濃度的也很重要，濃度太低，不能與靶蛋白完全結合。濃度太高會導致非特異性條帶增加背景。

陰性對照可以使用血清或lgG，陽性對照一般使用RNA Polymerase II或者組蛋白。

陰性對照：用實驗抗體同型的IgG作為抗體，理論上不會ChIP下來任何DNA片段，因此作為陰性對照，但是由于非特異結合，或者實驗過程中，沒發(fā)生結合的DNA清除不完全，可能也會出現(xiàn)條帶。如果陰性對照樣品中的產物量等于特異靶標樣品中產物量，說明特異靶標抗體未發(fā)揮作用或者染色質斷裂不充分。

陽性對照：為了保證陽性對照有效，一般選擇陽性對照的引物是根據管家基因設計的。一般用RNA Polymerase II或者Histone H3（組蛋白）抗體，因為RNA Polymerase II是通用轉錄因子，在所有細胞中都能結合基因的核心啟動子區(qū)。因此，理論上ChIP后PCR都會有條帶。

需設計已經確定的、不與特異抗原相結合的DNA片段的引物，用來排除抗原和染色質的非特異結合。

交聯(lián)反應的逆轉

RNA酶、蛋白酶需65℃保溫6小時
不加蛋白酶可以提取、分析結合蛋白

DNA的純化

最好用試劑盒，便于后面的PCR檢測

DNA的鑒定

1、可以進行二代測序或者QPCR檢測結果

  因為ChIP實驗涉及的步驟多，結果的重復性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照，而且對結果的分析也需要有一定的經驗。如果ChIP實驗方面有什么問題，歡迎與我們交流哦！