一箭N雕，lncRNAi實現腫瘤精準治療

由于引起腫瘤的發生是一個復雜的網絡，因此，是否可以通過一次靶向多個OncomiR進行腫瘤治療呢？今天，小編通過一篇發表在《Molecular Cancer Therapeutics》上的研究，來看看科學家們怎么使用lncRNAi的方法，通過靶向多個OncomiRs來實現HCC的精準治療。

研究背景

腫瘤的精準醫療是現在大家關注的熱點，針對小分子的腫瘤靶向治療是熱點中的熱點。已有研究表明，在腫瘤發生，增殖，轉移過程中，存在著大量的異常表達miRNA，稱之為“OncomiR”。而這些OncomiRs通過靶向下游mRNA，調控了功能基因的轉錄后調控。針對腫瘤細胞中過量表達的miRNA，通過miRNA抑制劑或者antisense 序列來人為降低miRNA的表達，是可以抑制腫瘤生長的，已有的研究也是從這個方向多發，抑制某一個miRNA的表達來實現腫瘤治療。但是，這種方法的局限性在于，由于一個miRNA可以調控多個mRNA，而一個mRNA又受到不同的miRNA的調控，如果只干預了一個miRNA的表達，通常情況下是很難實現對整個調控網絡的干預而導致治療效果不佳。針對這樣一個生物學問題，本研究通過lncRNAi的方式，人為合成一條長鏈非編碼RNA，通過同時靶向多個不同的miRNA分子，來實現對HCC的精確治療。這個方法是否可行呢？讓我們一起往下看。

研究結果

1、HCC細胞lncRNAi模型建立與確認
為了同時干預多個OncomiRs，研究人員腺病毒載體構建了同時能靶向12個miRNA(miR21,miR221/222,miR224,miR17-5p/20a,miR10b,miR106b,miR151-5p,miR155,miR181a/181b,miR184,miR1和miR501-5p)，AdSVPE1a-lncR。結果顯示，在HepG2,Hep3B,MHCC97H，Huh-7和PLC/PRF /5細胞系中都能表達，而在正常肝細胞系WRL-68和L02中不能表達。HepG2, Hep3B,MHCC97H, Huh-7, PLC/PRF/5 SMMC-7721, MHCC97L細胞中能檢測到高的E1a表達，而在BEL-7402, WRL-68, L02細胞中表達很弱。在SMMC-7721和MHCC97L細胞中，AdSVPE1a-lncR的復制水平有成百倍，而在正常細胞系L02和WRL-68中復制水平很低。因此，研究人員成功的將lncRNAi體系在HCC細胞系中實現了表達。

2、lncRNAi下游靶基因影響鑒定

qRT-PCR檢測顯示，AdSVPE1a-lncR–mediated lncRNAi表達水平在Huh-7,Hep3B和HepG2細胞中比較高，在PLC/PRF/5, MHCC97H, BEL-7402,MHCC97L, and SMMC-7721相對比較低，而在WRL-68和L02細胞中很低。那么，lncRNAi是否可以影響下游miRNA及靶基因表達呢？結果顯示，miR21和miR17-5p在HepG2細胞中顯著抑制，相應的靶基因PTEN有明顯上調。進一步的熒光素酶檢測也表明pGL3-miR21/17-5p在HepG2相比L02細胞表達明顯低。因此，lncRNAi可以抑制OncomiRs來保護下游靶基因。

3、lncRNAi影響HCC細胞的增殖和遷移能力

lncRNAi在細胞中能起作用，那么會影響哪些細胞的生物學功能呢？結果顯示，AdSVPE1a-lncR有非常顯著的Hep3B和Huh-7細胞殺傷能力。在Hep3B細胞中加入MOI=0.5 pfu/cell ，細胞存活不到50%，加入MOI=2 pfu/cell，細胞存活不到10%。在其他細胞系，HepG2,MHCC97L,PLC/PRF/5,MHCC97H和SMMC-7721細胞在加入MOI=100 pfu/cell時，存活也少于50%。但是，對BEL-7402細胞的細胞殺傷卻不顯著，對正常肝細胞系沒有顯著殺傷力。因此，lncRNAi只有對腫瘤細胞具有殺傷力，影響其增殖能力。細胞遷移和侵襲能力檢測也表明，AdSVPE1a-lncR能顯著抑制HepG2, MHCC97H, PLC/PRF/5, Hep3B, Huh-7細胞的遷移和侵襲能力，而在BEL-7402, SMMC-7721, MHCC97L細胞中的抑制能力相對較弱。因此，lncRNAi顯著抑制了腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。

當HCC細胞感染AdSVPE1a-lncR后，PLC/PRF/5, Hep3B, Huh-7細胞滯留在G0-G1階段。PLC/PRF/5 ,Hep3B細胞滯留在G2-M階段。HepG2和 MHCC97H細胞滯留在S階段。但是，BEL-7402, SMMC-7721, MHCC97L的細胞周期影響較弱。

另外，在這些感染細胞中，所有細胞系的細胞凋亡比率顯著增加，而BEL-7402，WRL-68和L02細胞的凋亡比率不顯著。因此，lncRNAi只會影響HCC細胞的凋亡過程。

4、 lncRNAi作用分子機制探究

既然HCC細胞的生物學功能發生了變化，那么，其內在的分子機制是什么呢？通過對AdSVPE1a-lncR ，AdSVPeGFP-lncR（對照）感染細胞系全基因組表達譜篩選（由上海伯豪提供），發現AdSVPE1a-lncR感染的4個不同細胞系有2091個差異基因，而AdSVPeGFP-lncR只有101個差異。其中，271個共有上調和176個共有下調基因中，上調基因主要是凋亡誘導基因和增殖抑制基因。Western blot實驗也驗證PTEN和p27kip1顯著增加。

AdSVPE1a-lncR感染后mRNA發生變化，miRNA是否也有變化呢？通過全基因組miRNA表達譜芯片檢測，研究人員發現HCC細胞中有大量的miRNA表達發生改變。

qRT-PCR顯示，只有miR21在所有的HCC細胞中都表達下調。

5、lncRNAi作用效果體內實驗驗證

細胞實驗表明lncRNAi確實對腫瘤細胞產生效果，芯片檢測也表明改變的基因和miRNA也確實和增殖凋亡相關。那么，這樣的效果在體內是否也一致呢？將AdSVPE1a-lncR治療后的Huh7和HepG2細胞移植裸鼠，21天后，治療組腫瘤體積減小。同時，Huh-7細胞移植模型的腫瘤質量在治療后也明顯低于對照。

進一步的實驗和免疫組化檢測也表明miRNA靶基因PTEN和p27kip1表達顯著增加，而CDK4，p38/MAPK，Survivin表達顯著降低。

為了更進一步的確認體內作用效果，研究人員用病人樣本的PDX小鼠模型進行了實驗。結果顯示，治療28天后，腫瘤質量顯著減少。治療后，miRNA的靶基因PTEN表達顯著增加，Survivin表達顯著降低。因此，基于AdSVPE1a-lncR的lncRNAiHCC腫瘤治療確實能夠起到作用效果，是一種潛在的HCC治療方法。

研究結論

該研究采用lncRNAi的方法，在HCC細胞中同時靶向多個高表達miRNA，從而通過保護下游靶基因實現對腫瘤的治療，從細胞角度，基因層次和體內小鼠模型實驗確實表明lncRNAi能夠用來治療HCC，該研究為腫瘤的精準醫療提供了一種新的方法，值得大家學習參考。

原文出處：Li X, Su Y, Sun B, Ji W, Peng Z, Xu Y, Wu M, Su C.An Artificially Designed Interfering lncRNA Expressed by Oncolytic Adenovirus Competitively Consumes OncomiRs to Exert Antitumor Efficacy in Hepatocellular Carcinoma.Mol Cancer Ther. 2016 .