1. 將未開封的測試片貯藏在<= 8 oC (46 oF)的環境下，并在包裝上標示的有效期內使用。在高濕度的地方，最好在使用前將測試片回復到室溫。

 

2. 已開封的測試片，將開口反折，用膠帶封好。

 

3. 為防止暴露于潮濕的環境中，請不要冷藏已開封的測試片。將膠帶封好的測試片貯藏在低溫干燥的地方，保持時間不超過1個月。請勿將測試片放在溫度> 25 oC (77 oF)和(或)相對濕度> 50%的環境中。

 

4. 用涂抹棒、海棉或其它采樣設備收集環境樣本。濕潤采樣設備的液體應<= 10 mL。濕潤劑可以是無菌水、緩沖蛋白胨水(Buffered Peptone Water, BPW)，或中和緩沖液，如Letheen肉湯或Dey/Engley (DE)中和肉湯。

 

5. 在無菌環境下在收集的樣品中添加5 mL，20-30oC，滅過菌的緩沖蛋白胨水(BPW)溶液。 不要將Petrifilm EL測試片與Vermont 培養基(UVM)、Fraser肉湯、李斯特菌增菌培養基 (LEB)或緩沖李斯特菌增菌培養基(BLEB)共用。

 

6. 混合，蠕動或旋轉樣品與BPW的混合液將近一分鐘。將樣品置于室溫(20-30 oC) 1h，最久不超過1.5 h，以修復損傷的李斯特菌。

 

7. 將測試片置于平坦表面處，揭開上層膜。

 

8. 用3MTM電子移液槍或其它移液器垂直滴加3 mL樣品到下層膜的中央。

 

9. 將上層膜緩慢蓋下，以免產生氣泡。

 

10. 輕輕地將塑料壓板放在位于接種區上層膜上。不要壓，扭轉或滑動壓板。提起壓板。等至少10分鐘，以使膠體凝固。

 

11. 將測試片透明面朝上，可疊放至10片，在35oC ± 1oC或37oC ± 1oC下培養28h ± 2 h。

 

12. Petrifilm EL測試片能夠用標準的菌落計數器或其它光學放大器計數或判讀。不要計數圓形輪廓上的菌落，因為它們不受選擇性培養基的作用。

 

 

              

    未檢出                        檢出

 

13. 對于定性檢測，根據紫紅色菌落的存在與否，將結果計為檢出和未檢出。

如果是/否的結果已經能夠滿足報告要求，那么你可以選擇定性檢測。

 

14. 對于半定量檢測，根據出現紫紅色菌落的相對量來記錄結果。 如果你是根據菌落數的相對含量來采取相應的措施，并且沒必要記錄實際菌落數，那么你可以選擇半定量檢測。李斯特菌的含量應記錄為對采樣區域和企業標準有指導意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)

 

15. 對于定量檢測，計數所有紫紅色菌落。 如果你根據菌落數來采取相應的措施，你可以采用定量檢測。測試片上李斯特菌數：16

請參考判讀手冊的“定量采樣與判讀”部分來計算每個環境樣本中的李斯特菌數。

 

16. 可挑區菌落進行進一步鑒定。掀起上層膜，從膠上挑取菌落。

 

 

如果你以定量方式使用3M Petrifilm EL 測試片，請參考產品的包裝插件，然后按下述方式計算單位面積的菌落數(Colony Forming Units, CFU)。同時，你也要注意以下幾點：

 

1.穩定性是在環境監控過程中獲得有用信息的關鍵點，所以在采樣過程中應使用相同的步驟。理想情況下，應使用相同類型的取樣設備，模板面積，技術員和采樣技術。

2.采樣面積的大小可根據法規，內部標準，和(或)監控地點的不同來設定，例如考慮到較低的細菌數，對成品線應采用較大的采樣面積。

3.更多關于環境采樣的信息，請見如下的參考文獻，或參考3M Petrifilm 測試片環境監控手冊。

 

為了測定單位采樣面積的李斯特菌數，你需要記錄以下數據：

1. 采樣面積

2. 濕潤采樣設備的液體量

3. 添加緩沖蛋白胨水的體積

4. 接種體積

5. 測試片上的李斯特菌數

運用如下的等式和表格來計算單位采樣面積的菌落數 (CFU/area sampled)。實例請見下頁。方法的詳細內容請見包裝插件和操作說明。

 

你也可以測定單位樣本的結果，如 CFU/每份排放水

或

環境定量采樣符合以下文獻：

Standard Methods for the Examination of Dairy Products, Section 3.7D, American Public Health Association, Washington D. C., 1992.

Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, Section 3.512 and 3.521, American Public Health Association, Washington D. C., 2001

 

 

1. 用10 mL液體濕潤海綿，涂抹采樣面，如面積為1平方英尺(1 ft2)。

 

2. 將海綿放回無菌容器，加入5 mL緩沖蛋白胨水(BPW)。

 

3. 修復完成后，吸取3 mL混合液接種到Petrifilm EL測試片。

 

4. 培養后，進行菌落計數 (在本例中，假設菌落數為90)。

 

 

1. 用1 mL液體濕潤涂抹頭，涂抹采樣面，如面積為50平方厘米(50 cm2).

 

2. 將涂抹棒放回無菌容器中，添加5 mL緩沖蛋白胨水(BPW)。

 

3. 修復完成后，吸取3 mL混合液接種到Petrifilm EL 測試片。

 

4. 培養后，進行菌落計數 (在本例中，假如菌落數為90)。

 

二、測試環境李斯特菌 判讀方法  

 

3MTM PetrifilmTM Environmental Listeria(EL) 測試片是一種預先制備好的培養基，含有選擇性試劑，營養成分，冷水可溶性的凝膠和有助于菌落檢測的顯色指示劑。Petrifilm EL 測試片可用于檢測或計數環境樣本中的李斯特菌數。Petrifilm EL 測試片檢測的李斯特菌包括單核增生李斯特菌(L.monocytogenes) 英諾克李斯特菌 (L.innocua)，格氏/墨氏李斯特菌(L.grayi/murrayi)，威爾李斯特菌(L.welshimeri)，但不能區分各種菌。

 

環境條件和消毒劑可能會抑制或損傷微生物。緩沖蛋白胨緩沖液(Buffered Peptone Water, BPW) 能用作修復肉湯和Petrifilm EL測試片結合使用。但李斯特菌在緩存蛋白胨緩沖液中的修復過程不是增菌步驟。

 

1. 圖1 為長有李斯特菌的典型Petrifilm EL 測試片。判讀或計數所有的紫紅色菌落為李斯特菌。如果在26-29 小時，有灰色或淡粉紅色菌落存在，需繼續培養。在培養時間內，由灰色或淡粉紅色加深為紫紅色的菌落應判定為李斯特菌。在最大培養時間(30小時)仍保持灰色或淡粉紅色的菌落不應判讀為李斯特菌。不考慮或計數圓形輪廓上的菌落，因為它們不受選擇性培養基的作用。

 

定性判讀： 測試片檢出李斯特菌。

 

半定量判讀：李斯特菌的含量應記錄為對采樣區域和企業標準有指導意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。

 

定量判讀： 測試片上的李斯特菌數：11。

 

請參考判讀手冊的“定量采樣與判讀”部分來計算每個環境樣本中的李斯特菌數。

 

2. 該Petrifilm EL 測試片在培養30小時后沒有菌落生長，實驗結束。

 

定性判讀： 測試片上未檢出李斯特菌。

 

半定量判讀：李斯特菌的含量應記錄為對采樣區域和企業標準有指導意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。

 

定量判讀：測試片上的李斯特菌數：< 1。

 

請參考判讀手冊的“定量采樣與判讀”部分來計算每個環境樣本中的李斯特菌數。

 

3. Petrifilm EL測試片對李斯特菌具有選擇性，其菌落顯示為紫紅色。

 

定性判讀： 測試片上檢出李斯特菌。

 

半定量判讀：李斯特菌的含量應記錄為對采樣區域和企業標準有指導意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。

 

定量判讀：測試片上的李斯特菌數：84 。

 

請參考判讀手冊的“定量采樣與判讀”部分來計算每個環境樣本中的李斯特菌數。

 

4. 由于Petrifilm EL測試片的判讀方式有三種，所以沒有建議的計數范圍。當菌落密集時，按以下方式判讀定性或半定量的結果，或估算定量的結果。

 

定性判讀：測試片上檢出李斯特菌。

 

半定量判讀：李斯特菌的含量應記錄為對采樣區域和企業標準有指導意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。

 

定量判讀：測試片上估算的李斯特菌數：約460。當大量李斯特菌存在時，通過計數兩個或兩個以上的具有代表性方格的菌落數來估算。計算每個方格的平均菌落數數后乘以42。Petrifilm EL測試片的接種面積近似42 cm2。

 

5. 當菌落數很多時，測試片上可能有許多小的，不清楚的菌落，和(或) 呈現全部的粉紅色至棕色。

 

定性判讀：測試片上檢出李斯特菌。

 

半定量判讀：李斯特菌的含量應記錄為對采樣區域和企業標準有指導意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。

 

定量判讀：測試片上的李斯特菌數為多不可計(Too Numerous To Count, TNTC)。該圖中的菌落數近似104。

 

6. 背景顏色可能會因為環境樣本中的灰塵、泥土、砂子、或其它沉淀物而發生變化，也可能是因為采樣設備和(或) 緩沖蛋白胨水(修復液)的品牌不同而引起。紫紅色菌落判讀為李斯特菌。

 

定性判讀：測試片上檢出李斯特菌。

 

半定量判讀：李斯特菌的含量應記錄為對采樣區域和企業標準有指導意義的形式(如低，中，高，或可接受和不可接受)。

 

定量判讀：測試片上的李斯特菌數：11。

 

請參考判讀手冊的“定量采樣與判讀”部分來計算每個環境樣本中的李斯特菌數。