一、實驗材料準備


1.  處死孕鼠，全身置于75%酒精里浸泡，然后在超凈臺中用剪刀和鑷子將孕鼠皮膚剪開，用另外一組剪刀、鑷子剪開腹部肌層，露出子宮，最后用第三組剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

 

2.  用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30 ml D-PBS的50 ml離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉D-PBS，再重復此步驟一次，注意要留少許D-PBS，然后將胚胎轉移到另一裝有D-PBS的平皿中，并用手術刀片將其細細切碎。

 

3.  用200 μl的移液槍反復、快速地吹打平皿中的液體，轉移至15 ml離心管中，于4℃ 1500 rpm離心5分鐘，倒掉上清，以10 ml胰酶重懸沉淀，放在37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

 

4.   將上層細胞懸液倒入一個裝有10 ml MEF生長培養基的50 ml離心管中，用200目的尼龍網過濾后，以1 500 rpm離心5分鐘收集細胞，再用30 ml MEF生長培養基洗滌兩次。

 

5.  細胞沉淀用15 ml MEF生長培養基重懸后進行細胞計數(一般8只14天的胎鼠可獲得2-3×10⁷細胞)。

 

6.   3×10⁶細胞懸浮于15 ml MEF生長培養基中，接種到200 ml培養瓶中。

 

7.  24小時后更換新鮮的MEF生長培養基。

 

8.  細胞長滿后，先用D-PBS沖洗，倒掉后加胰酶消化(此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘)，按1:5傳代。

 

9.  細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規凍存(凍存液要現配)。