CHO細胞無血清培養入門技術手冊

——深圳百恩維生物

1、CHO細胞背景

      CHO細胞是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國科羅拉多大學Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細胞，是目前生物工程上廣泛使用的細胞系。工業生產上應用較多的是CHO-K1細胞，為轉化細胞系，細胞染色體分布頻率是2n＝22，系亞二倍體細胞。ATCC保存CHO-K1細胞株，編號為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達。由于該細胞存在遺傳缺陷，無脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉變為谷氨酸-γ-半醛，培養過程中需在培養基中添加L-脯氨酸才能生長。并且由于該細胞已經霍亂毒素適應，形態學有所改變。最初細胞為貼壁型細胞，經多次傳代篩選后，也可懸浮生長。

2 、CHO 細胞表達系統的優勢與特點

     由于哺乳動物細胞結構、功能和基因表達調控的復雜性，外源基因在哺乳動物細胞中的表達與在原核生物中的表達存在較大差異，因而外源基因在哺乳動物細胞中高效表達所需的元件也不同于在原核生物細胞中的表達所需的元件。外源基因在哺乳動物細胞中的表達包括基因的轉錄、mRNA 翻譯及翻譯后蛋白質的加工等過程，如蛋白質的糖基化、磷酸化、寡聚體的形成以及蛋白質分子內或分子間二硫鍵的形成等比較復雜，要表達具有生物學功能的蛋白質如膜蛋白、抗體和具有特異性催化功能的酶需要在哺乳動物細胞中進行。哺乳動物基因表達宿主細胞選擇的基本原則是來源豐富、轉化效率高、表達效果好，CHO 細胞作為表達系統除具有上述的特點要求外，還有以下優勢：

1）外源基因被整合到宿主染色體上后，在沒有選擇壓力的情況下能穩定保持；

2）適合多種蛋白質的分泌表達和胞內表達，并且很少分泌自身的內源蛋白，便于下游產物分離純化；

3）對培養基的要求較低，可在無血清培養基中培養；

4）細胞可進行貼壁培養也可進行懸浮培養，且具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力；

5）可進行高密度大量培養，進行較大規模生產時其培養量可放大到20000L 以上，是目前應用最廣泛的哺乳動物基因表達受體細胞之一。

    另有研究者嘗試將類胰島素生長因子IGF 基因和轉鐵蛋白基因轉入CHO 細胞獲得能自身分泌必需蛋白的“超級CHO”，無需在培養基中轉鐵蛋白和胰島素，細胞可在無血清培養基（SFM）中生長良好。

3、CHO細胞無血清無動物源成分培養基

     帶血清的細胞培養基因為血清的組成具有不確定的性，可控性、重現性都比較差，不利于產業化、規模化。而無血清無動物源培養基組成確定，重現性、可控性都比較好，因此不管是科研客戶還是臨床治療客戶，越來越趨向于采用無血清無動物源的培養基來培養CHO細胞。目前, 大部分CHO細胞培養均可在無血清培基中進行, 采用無血清培養取代傳統血清培養已成為CHO細胞培養的發展必然趨勢。無血清培基已廣泛應用于細胞生物學、藥理學、腫瘤學、細胞工程領域和臨床治療。

     深圳百恩維生物依托于在細胞培養基研發和動物細胞大規模培養方面具有豐富經驗的研發團隊，潛心研究，開發研制了多種個性化培養基，通過在生產實踐中的應用已取得可喜的成果，如CHO細胞無血清無動物組分細胞培養基（BW12009）就是其中之一。

4、百恩維CHO細胞無血清培養基（BW12009）的特點

     BW12009是深圳百恩維生物開發的新一代CHO細胞無血清無動物組分細胞培養基，能支持多種CHO細胞的生長維持，可廣泛應用于CHO細胞的無血清懸浮培養及抗體、重組蛋白、疫苗的生產過程。細胞培養基產品的生產、檢驗嚴格執行GMP管理和ISO9001管理體系，符合生物制藥原輔料要求，質量穩定可靠。

1）系無血清無動物組分培養基，化學成分明確，保證了細胞培養中原輔料的使用安全性；

2）支持多種CHO細胞系的生長，包括貼附型與懸浮型細胞培養，具有較為廣泛的適用性；

3）可維持CHO細胞高密度培養，細胞增殖速度快，適用于實驗研究和大規模培養應用；

4）根據用戶的不同使用，可定制培養基，以滿足各種等不同系統的應用需求；

5）有多種包裝規格可供選擇，滿足不同用戶的使用需求。

5、定制CHO 細胞無血清培養基

     CHO 細胞存在多種克隆細胞系，ATCC 保存的CHO 細胞就多達38 種，再加上研究單位或百恩維類似的公司構建的細胞，其克隆細胞數量遠不止這些。對于CHO細胞無血清培養而言，由于構建的各種高性能CHO 細胞系不同，不同克隆細胞的營養要求也都非常的不同，對營養要求往往是個性化的。另外，CHO 細胞培養過程的不同培養階段、重組CHO 細胞株的各個階段，細胞代謝所需的營養或限制因素也是不同的，即同一CHO細胞系在整個培養過程也需要使用不同的培養基，需要與之相對應的個性化培養基。百恩維已經為多家世界著名的生物制藥公司提供個性化的CHO 細胞無血清培養基。

6、CHO 細胞無血清馴化

     在含血清培養基中生長的 CHO 細胞可經過一定的細胞馴化過程，適應 細胞培養基，進行細胞的無血清培養。百恩維提供已馴化過的CHO 細胞系。如果需要，研究者也可按照以下辦法進行CHO 細胞無血清馴化。

     已經適應無血清培養的CHO 細胞可直接在BW12009中實現無血清培養培養，建議前二代的細胞密度不低于4×105cells/ml。

細胞的無血清馴化過程如下：

1. 取處于對數生長期的貼壁 CHO 細胞，活率大于95%，開始進行無血清馴化。

2. 細胞馴化可以在方瓶（T-flask）、搖瓶（shake-flask）或轉瓶（spinner-bottle）中進行。

3. 將無血清細胞培養基和含血清培養基的按 1：1（V/V）的比例進行混合，接種密度為2－4×105cells/ml 的細胞，在37℃、5％CO2 培養箱進行培養。

4. 根據細胞生長和活率情況，在降血清的每一階段可穩定傳代 1－3 代，接種密度維持在2- 4×105cells/ml。

5. 逐步提高無血清細胞培養基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，傳代過程的細胞接種密度仍維持為2- 4×105cells/ml。直至混合液中的血清濃度降低至 0.1-0.2%，每一代的細胞活率大于90％后，此時可將細胞完全培養在CHO 無血清無動物組分培養基中。

6. 在 CHO 無血清無動物組分培養基中進行放大培養，建立起適應無血清無動物組分培養的CHO 種子細胞庫。