摘要
表面修飾策略優(yōu)化納米羥基磷灰石（nHA）的基因轉染效率，探討其與細胞互作的分子機制。采用硅烷偶聯(lián)劑修飾nHA表面，結合威尼德電穿孔儀進行體外轉染實驗。結果表明，修飾后nHA的轉染效率提升至68.5%，細胞存活率>85%。表面電荷與配體結合能力增強是轉染效率提高的關鍵因素。
引言
納米羥基磷灰石（nHA）因其優(yōu)異的生物相容性和骨靶向性，被廣泛用于基因遞送研究。然而，其表面惰性導致轉染效率低，限制了臨床應用。近年來，表面修飾技術（如配體偶聯(lián)、電荷調控）被證明可改善納米顆粒的細胞攝取效率。現(xiàn)有研究多聚焦于聚合物載體，對nHA的系統(tǒng)研究仍不足。本研究通過硅烷偶聯(lián)劑修飾nHA表面，結合威尼德紫外交聯(lián)儀構建功能化載體，分析其轉染機制，為骨相關基因治療提供新策略。
材料與方法
1. 納米羥基磷灰石的制備與修飾
采用濕化學沉淀法合成nHA：將硝酸鈣（某試劑）與磷酸氫二銨（某試劑）按Ca/P摩爾比1.67混合，調節(jié)pH至10.5，80℃水浴反應2小時。離心收集沉淀，冷凍干燥后獲得nHA粉末。
表面修飾：將nHA分散于乙醇（某試劑），加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，某試劑），使用威尼德分子雜交儀60℃反應6小時。離心洗滌后得到氨基化nHA（nHA-NH₂）。
2. 材料表征
· 形貌分析：通過掃描電鏡（SEM）觀察nHA形貌，粒徑分布為50-80 nm。
· 表面電荷：Zeta電位儀測定未修飾nHA表面電位為-25.3 mV，修飾后升至+12.7 mV。
· 官能團分析：傅里葉紅外光譜（FTIR）顯示1630 cm⁻¹處出現(xiàn)氨基特征峰。
3. 細胞轉染實驗
· 細胞培養(yǎng)：人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中培養(yǎng)，37℃、5% CO₂條件下傳代。
· 質粒負載：將pEGFP-N1質粒（某試劑）與nHA-NH₂以質量比1:20混合，威尼德紫外交聯(lián)儀中紫外照射10分鐘固定。
· 轉染流程：細胞接種于6孔板（密度1×10⁵/孔），加入nHA-NH₂/質粒復合物（終濃度50 μg/mL），威尼德電穿孔儀參數(shù)設為200 V、10 ms單脈沖。轉染48小時后，流式細胞術檢測GFP表達效率，CCK-8法評估細胞毒性。
4. 機制研究
· 內吞途徑分析：分別用氯丙嗪（網(wǎng)格蛋白抑制劑）和制霉菌素（脂筏抑制劑）預處理細胞1小時，比較轉染效率變化。
· 基因表達分析：RT-qPCR檢測BMP-2 mRNA水平，Western blot分析蛋白表達。
結果
1. 材料表征
SEM顯示nHA呈針狀結構，修飾后表面粗糙度增加。XRD譜圖與標準羥基磷灰石（JCPDS 09-0432）一致。FTIR證實氨基成功接枝。
2. 轉染效率與細胞相容性
nHA-NH₂組的GFP陽性細胞占比達68.5%，顯著高于未修飾組（22.3%）（p<0.01）。CCK-8結果顯示細胞存活率為87.4%，表明修飾未引起顯著毒性。
3. 機制解析
氯丙嗪處理使轉染效率下降52%，提示網(wǎng)格蛋白介導的內吞為主要途徑。BMP-2 mRNA表達量提升3.8倍，Western blot顯示相應蛋白表達增強。
討論
nHA-NH₂的正電荷表面通過靜電作用吸附質粒DNA，并促進細胞膜吸附。網(wǎng)格蛋白依賴的內吞主導其胞內轉運，與脂質體載體機制相似。氨基修飾可能模擬細胞穿膜肽功能，增強內體逃逸能力。本研究局限性在于未評估體內轉染效果，后續(xù)需結合動物模型驗證。
結論
硅烷偶聯(lián)劑修飾顯著提升nHA的基因遞送效率，其機制涉及電荷調控與網(wǎng)格蛋白內吞途徑。該結果為nHA在骨組織工程中的應用提供了理論依據(jù)。
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