小鼠膽管癌細胞LD-1培養步驟說明書
一、細胞培養條件
二、細胞收貨后處理
A、復蘇細胞處理方法：培養至良好狀態后灌滿完全培養液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法。收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶，嚴格無菌后將細胞瓶放置培養箱中靜置2-4小時以穩定細胞狀態。靜置后顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據，不提供照片默認收到狀態良好。
B、凍存細胞處理方法：收到細胞后，觀察泡沫箱中干冰是否有剩余，凍存管是否完好無損是否有解凍情況，若發現干冰完全汽化或凍存管有解凍破損現象，請及時拍照并與我們聯系。如果細胞簽收三天內未與我們聯系，則默認為收貨良好。復蘇第一管如有活性問題，請及時聯系我們，技術人員與您溝通指導后再復蘇第 二管，未與我方聯系擅自復蘇第二管出現問題不予售后。
三、細胞培養步驟
a、細胞傳代：如細胞密度超80%，即可進行傳代培養，步驟如下：
1) 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次；
2) 加1-2mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置培養箱中消化 1-2min ，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后，加5ml以上含10%血清的完全培養基終止消化；
3) 輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出至離心管中，1000 rpm離心5-8min，棄去上清液，補加1-2mL完全培養基后吹勻；
4) 按5-6mL每瓶補加完全培養基，將細胞懸液按1:2的比例分到新的含5-6 mL完全培養基的6cm培養皿中或者T25培養瓶中。
（即1個T25瓶傳代接種至2個T25瓶或者2個6cm的培養皿）
b、細胞凍存：細胞收集參照傳代步驟，按凍存數量（推薦每支凍存管5×106左右細胞數量凍存），加入1ml的我司無血清凍存液（貨號：C7001），輕輕混勻后，放-80℃冰箱，24小時后轉入液氮罐中。
C、細胞復蘇：從液氮灌或-80℃冰箱中找到需要復蘇的細胞，水浴鍋提前打開預熱37℃。
1) 將凍存細胞在37℃水浴中迅速搖晃解凍；
2) 將凍存管中的細胞移至含5ml完全培養基的離心管中，1000 rpm離心5min；
3) 棄去上清液，補加5mL完全培養基后吹勻，接種于T25培養瓶中或6cm皿中，培養過夜，第二天換液并檢查細胞密度。
四、注意事項：有些細胞貼壁不牢，在運輸過程中細胞容易脫落，這是正常現象。如脫落較多可將培養瓶所有培養液收集至離心管，1000rpm離心5-8min，收集上清作過渡培養，沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml完全培養基終止反應。再離心，棄上清，加1-2ml完全培養基重懸。然后按1:2比例進行分瓶傳代，補充新的完全培養基至5-6ml/瓶，最后放入細胞培養箱中培養。
五、售后條款：
1）細胞出現問題，可重發的情況有哪些？判定標準是什么？
1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題，細胞丟失、瓶身破損、培養液嚴重漏液等，重發；
2. 細胞污染問題，請在收到產品48小時內，給我們提出真實的實驗結果，核實后重發；
3. 常溫發貨的細胞靜置24小時后，干冰凍存發貨的細胞復蘇后24小時后，絕大多數細胞未存活，（需提供真實清晰的細胞狀態照片），重發；
4. 干冰凍存發貨的細胞復蘇后24小時后或常溫發貨的細胞靜置4小時候并且未開封，出現污染，重發；
5. 細胞活性問題，請在收到產品7天內給我們提出真實的實驗結果，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力，核實后予重發；
6. 細胞收到當天以及第2,3天請拍照，3天未告知的，視為產品合格。4-7天內出現問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現問題時照片以及細胞相關操作的詳細步驟的，并跟技術人員溝通的，由技術人員判定為我方責任的，重發。技術人員判定為雙方承擔責任的由雙方進行協商處理或者按合同價的50%收費重發。
2）細胞出現問題，不予以重發的情況有哪些？
1. 客戶造成細胞污染，不重發；
2. 客戶不正確操作致細胞狀態不好，不重發；
3. 非本庫推薦細胞培養體系致的細胞狀態不好，不重發；
4. 細胞狀態不好，未提供細胞培養前3天照片的，不重發；
5. 細胞培養時經其它處理的，不重發；
6. 細胞收到2天內，未告知，不重發；
7. 視具體情況而定。
發表中文論文標注：（細胞名稱貨號）由上海雅吉生物科技有限公司提供；
發表英文論文標注：（細胞名稱貨號）Provided by Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd
| 培養條件 | 空氣，95%；CO2，5% ；37℃ | ||
| 生長特性 | 貼壁生長 | 凍存條件 | 無血清凍存液（貨號：C7001） |
| 培養體系 | DMEM+10%FBS+1%P/S | ||
| 傳代方法 | 第一次建議1:2傳代 | 傳代情況 | 2天換液 |
| 備注 | 天氣寒冷可能會導致細胞冷縮脫落，如脫落較多，參考下列（四、注意事項），如脫落不多正常操作即可。瓶中完培可收集使用。 | ||
二、細胞收貨后處理
A、復蘇細胞處理方法：培養至良好狀態后灌滿完全培養液并封好瓶口是運輸細胞的最好辦法。收到細胞用75%酒精噴灑整個細胞瓶，嚴格無菌后將細胞瓶放置培養箱中靜置2-4小時以穩定細胞狀態。靜置后顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照保存（最好40x,100x,200x各一張），前三天照片是重要售后依據，不提供照片默認收到狀態良好。
B、凍存細胞處理方法：收到細胞后，觀察泡沫箱中干冰是否有剩余，凍存管是否完好無損是否有解凍情況，若發現干冰完全汽化或凍存管有解凍破損現象，請及時拍照并與我們聯系。如果細胞簽收三天內未與我們聯系，則默認為收貨良好。復蘇第一管如有活性問題，請及時聯系我們，技術人員與您溝通指導后再復蘇第 二管，未與我方聯系擅自復蘇第二管出現問題不予售后。
三、細胞培養步驟
a、細胞傳代：如細胞密度超80%，即可進行傳代培養，步驟如下：
1) 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次；
2) 加1-2mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置培養箱中消化 1-2min ，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后，加5ml以上含10%血清的完全培養基終止消化；
3) 輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出至離心管中，1000 rpm離心5-8min，棄去上清液，補加1-2mL完全培養基后吹勻；
4) 按5-6mL每瓶補加完全培養基，將細胞懸液按1:2的比例分到新的含5-6 mL完全培養基的6cm培養皿中或者T25培養瓶中。
（即1個T25瓶傳代接種至2個T25瓶或者2個6cm的培養皿）
b、細胞凍存：細胞收集參照傳代步驟，按凍存數量（推薦每支凍存管5×106左右細胞數量凍存），加入1ml的我司無血清凍存液（貨號：C7001），輕輕混勻后，放-80℃冰箱，24小時后轉入液氮罐中。
C、細胞復蘇：從液氮灌或-80℃冰箱中找到需要復蘇的細胞，水浴鍋提前打開預熱37℃。
1) 將凍存細胞在37℃水浴中迅速搖晃解凍；
2) 將凍存管中的細胞移至含5ml完全培養基的離心管中，1000 rpm離心5min；
3) 棄去上清液，補加5mL完全培養基后吹勻，接種于T25培養瓶中或6cm皿中，培養過夜，第二天換液并檢查細胞密度。
四、注意事項：有些細胞貼壁不牢，在運輸過程中細胞容易脫落，這是正常現象。如脫落較多可將培養瓶所有培養液收集至離心管，1000rpm離心5-8min，收集上清作過渡培養，沉淀加入胰酶1-2ml，輕輕吹打，重懸，消化1-2分鐘后，加5ml完全培養基終止反應。再離心，棄上清，加1-2ml完全培養基重懸。然后按1:2比例進行分瓶傳代，補充新的完全培養基至5-6ml/瓶，最后放入細胞培養箱中培養。
五、售后條款：
1）細胞出現問題，可重發的情況有哪些？判定標準是什么？
1. 細胞運輸途中遭遇的各種問題，細胞丟失、瓶身破損、培養液嚴重漏液等，重發；
2. 細胞污染問題，請在收到產品48小時內，給我們提出真實的實驗結果，核實后重發；
3. 常溫發貨的細胞靜置24小時后，干冰凍存發貨的細胞復蘇后24小時后，絕大多數細胞未存活，（需提供真實清晰的細胞狀態照片），重發；
4. 干冰凍存發貨的細胞復蘇后24小時后或常溫發貨的細胞靜置4小時候并且未開封，出現污染，重發；
5. 細胞活性問題，請在收到產品7天內給我們提出真實的實驗結果，用臺盼藍染色法鑒定細胞活力，核實后予重發；
6. 細胞收到當天以及第2,3天請拍照，3天未告知的，視為產品合格。4-7天內出現問題有提供收到細胞前3天照片和細胞出現問題時照片以及細胞相關操作的詳細步驟的，并跟技術人員溝通的，由技術人員判定為我方責任的，重發。技術人員判定為雙方承擔責任的由雙方進行協商處理或者按合同價的50%收費重發。
2）細胞出現問題，不予以重發的情況有哪些？
1. 客戶造成細胞污染，不重發；
2. 客戶不正確操作致細胞狀態不好，不重發；
3. 非本庫推薦細胞培養體系致的細胞狀態不好，不重發；
4. 細胞狀態不好，未提供細胞培養前3天照片的，不重發；
5. 細胞培養時經其它處理的，不重發；
6. 細胞收到2天內，未告知，不重發；
7. 視具體情況而定。
發表中文論文標注：（細胞名稱貨號）由上海雅吉生物科技有限公司提供；
發表英文論文標注：（細胞名稱貨號）Provided by Shanghai Yaji Biotechnology Co., Ltd
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