WGBS+RNA-seq揭示PM2.5引起男性生殖障礙的DNA甲基化調控機制
2022年09月24日，陸軍醫科大學（第三軍醫大學）預防醫學院毒理學研究所張中豪博士等為第一作者，曹佳教授、劉晉祎教授為通訊作者以" Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure"為題在《Environment International》雜志發表研究論文。該研究通過對小鼠睪丸組織的全基因組重亞硫酸鹽測序（Whole gene bisulfite sequencing,WGBS）與對應的轉錄組測序（RNA-seq）聯合分析，鑒定出與類固醇生成和精子發生過程相關的關鍵基因和通路，揭示了PM2.5導致男性生殖障礙的潛在DNA甲基化調控機制。
標題：Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure（PM2.5暴露后類固醇生成和精子生成障礙的全基因組DNA甲基化變化和效應）
發表期刊：Environment International
發表日期：2022年09月24日
影響因子：IF 13.352
技術：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、轉錄組測序（RNA-seq）、蛋白質印記
樣品：8周齡C57BL/6雄性小鼠，分為過濾空氣組（filtered air group ,FA），未過濾空氣組（unfiltered air group ,UA）和濃縮PM2.5組(concentrated ambient PM2.5 group, CAP)。每組2個重復，共6個樣本。
摘要
環境細顆粒物（PM2.5）對男性生殖健康的影響已引起廣泛關注，其損害的具體潛在機制仍不清楚，需要在新的方向進行更多研究。先前研究表明，DNA甲基化在男性生殖發育中起著重要作用，也易受環境影響，然而對于DNA甲基化參與PM2.5誘導的男性生殖毒性作用還沒有足夠研究。為此，本研究建立一個實時PM2.5暴露模型，揭示了PM2.5暴露可能導致睪丸功能障礙，包括精子發生障礙和類固醇激素功能障礙。睪丸5-甲基胞嘧啶（5mC）全基因組水平降低表明DNA甲基化可能與PM2.5暴露誘導的睪丸損傷有關。進一步的全基因組甲基化分析揭示了睪丸DNA的基因組低甲基化，并在CAP組與UA組和FA組中發現1000多個差異甲基化區域（DMR），表明PM2.5暴露（即使低劑量）可以調控睪丸甲基化。此外，甲基化組和轉錄組的聯合分析鑒定出一些關鍵甲基化基因和網絡，這些基因和網絡可能參與精子發生和類固醇激素的合成。關鍵基因尤其是Cyp11a1和Pax8的睪丸甲基化水平升高，隨后表達水平降低可能會損害睪酮和精子生成過程。本研究為DNA甲基化可能參與PM2.5誘導的男性生殖損傷提供了基礎知識和新見解。
圖形摘要
睪丸全基因組DNA甲基化組和轉錄組的聯合分析鑒定了與類固醇生成和精子發生過程相關的關鍵基因和通路，這可能是PM2.5引起的男性生殖障礙中DNA甲基化調控機制。
研究思路
材料方法
8周齡C57BL/6雄性小鼠，過濾空氣組（FA），未過濾空氣組（UA）和濃縮PM2.5 組(CAP)。FA組為高效顆粒空氣過濾器過濾的環境空氣，UA組為未經過濾的環境空氣，CAP組為細顆粒物（PM2.5）暴露環境空氣。
從小鼠眼眶叢中獲得血液，稱重睪丸和附睪，分別固定在Bouin溶液中進行形態學分析和在液氮中速凍-80°C儲存。
從睪丸組織中分離提取RNA、DNA和蛋白質進行全基因組重亞硫酸鹽測序 （WGBS）分析、轉錄組測序（RNA-seq）和Western Blot實驗，WGBS為每組構建兩個庫，每個庫包含來自四只小鼠的合并睪丸DNA。
研究結果
（1）PM2.5暴露導致精子質量下降和精子發生損傷
圖2：PM2.5暴露導致精子發生障礙
（A）睪丸的典型病理圖像。三角形（基底膜中斷），黑色箭頭（空泡化）。
（B-C）在VII期曲細精管（n=15）中檢測曲細精管直徑（B）和上皮高度（C）的精子發生參數。
（D-H）每個VII期曲細精管的Sertoli細胞（D）、精原細胞（E）、粗線期精母細胞（F）、圓形精子細胞（G）和總生殖細胞（H）的計數（n=15）。
（I-L）精原細胞/Sertoli細胞比率（I）、粗線期精母細胞/Sertoli細胞比率（J）、圓形精母細胞/Sertoli細胞比率（K）、總生殖細胞/Sertali細胞比率（L）（n=15）。
單向方差分析，然后Tukey多重比較。與FA處理組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。
（2）PM2.5暴露誘發睪丸類固醇激素功能障礙
（D）血清T/LH在血清中的比值（D）（n=15）。
（E-G）睪丸水平，睪酮(T)（E）、LH（F）、FSH（G）（n=7）。
（H） 睪丸T/LH比值（n=7）。
（3）PM2.5暴露誘導睪丸全基因組低甲基化
（B） 基因組甲基化測序示意圖。
（C） 通過WGBS檢測睪丸基因組中所有CpG位點的全基因組DNA甲基化水平。
（D） 功能基因組區域mm10內5mC相對密度的基因組特征。
（E） PM2.5暴露組與FA組DMR鑒定。
（F和H） CAP組（F）和UA組（H）染色體上的顯著DMR。
（G和I） CAP組（G）和UA組（I）中鑒定的DMR基因組位置（啟動子、5’UTR、外顯子、內含子、3’UTR、基因間）（上：高DMR；下：低DMR）。
（J） DMR相關基因（DMG）生物過程的富集分析。點的顏色表示P值，點的大小是給定生物過程中的富集分數。
（4）基于DMR的功能相關基因
（B） 與FA組相比，CAP組中PDMGs的最高生物過程（top biological process）氣泡圖。每個圓圈表示不同的生物過程，大小表示富集-sore。X軸表示總差異基因中高甲基化和低甲基化基因數量差異比例。氣泡越向右，表示通路中高甲基化基因比例就越高。
（C） 啟動子區域的DMG以及染色體位置的曼哈頓圖。X軸代表染色體。Y軸是-log10 FDR。
（D） DNA甲基化peaks可視化Meioc基因座。橙色表示DMR區域。
（5）PM2.5暴露破壞了睪丸的轉錄組特征
（B） FA組、UA組和CAP組中DEG熱圖。
（C） DEG的KEGG分析。
（D） FA組和CAP組中類固醇激素生物合成過程基因組的GSEA分析。
（E） 睪酮生物合成通路分子圖。
（F） 與類固醇生成和精子發生相關的DEGs熱圖。塊的顏色表示每組的基因表達水平。
（6）DNA甲基化組和轉錄組聯合分析，鑒定與PM2.5暴露相關的關鍵甲基化基因
（B） 參與生殖功能的候選基因網絡。
（C） RT-PCR驗證睪丸中候選類固醇生成相關基因的mRNA表達水平（n=6）。
（D） RT-PCR驗證睪丸中候選精子發生相關基因的mRNA表達水平（n=6）。
（E） Cyp11a1基因DMR內代表性CpG甲基化譜。
（F） Pax8基因DMR內代表性CpG甲基化譜。
（G） western blot分析睪丸候選基因的蛋白表達水平。
（H） CYP11A1和PAX8的蛋白質定量分析（n=6）。
結論：
本研究表明PM2.5暴露可導致睪丸功能障礙，包括精子發生和類固醇激素功能障礙。作者揭示了PM2.5可以改變睪丸的甲基化水平，表明DNA甲基化可能參與PM2.5誘導的男性生殖損傷過程。睪丸全基因組DNA甲基化組和轉錄組的聯合分析鑒定了與類固醇生成和精子發生過程相關的關鍵基因和通路，這可能是PM2.5導致男性生殖障礙的DNA甲基化調控機制。本研究可能為PM2.5誘導男性生殖毒性的潛在表觀遺傳機制提供重要信息和新視角。
參考文獻：Zhang Z, Wang J, Shi F, Li Y, Zou P, Tang Y, Liu C, Wang Y, Ling X, Sun L, Liu C, Zhang Y, Gao F, Chen Q, Ao L, Han F, Liu J, Cao J. Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure. Environ Int. 2022 Sep 24;169:107544.
標題：Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure（PM2.5暴露后類固醇生成和精子生成障礙的全基因組DNA甲基化變化和效應）
發表期刊：Environment International
發表日期：2022年09月24日
影響因子：IF 13.352
技術：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、轉錄組測序（RNA-seq）、蛋白質印記
樣品：8周齡C57BL/6雄性小鼠，分為過濾空氣組（filtered air group ,FA），未過濾空氣組（unfiltered air group ,UA）和濃縮PM2.5組(concentrated ambient PM2.5 group, CAP)。每組2個重復，共6個樣本。
摘要
環境細顆粒物（PM2.5）對男性生殖健康的影響已引起廣泛關注，其損害的具體潛在機制仍不清楚，需要在新的方向進行更多研究。先前研究表明，DNA甲基化在男性生殖發育中起著重要作用，也易受環境影響，然而對于DNA甲基化參與PM2.5誘導的男性生殖毒性作用還沒有足夠研究。為此，本研究建立一個實時PM2.5暴露模型，揭示了PM2.5暴露可能導致睪丸功能障礙，包括精子發生障礙和類固醇激素功能障礙。睪丸5-甲基胞嘧啶（5mC）全基因組水平降低表明DNA甲基化可能與PM2.5暴露誘導的睪丸損傷有關。進一步的全基因組甲基化分析揭示了睪丸DNA的基因組低甲基化，并在CAP組與UA組和FA組中發現1000多個差異甲基化區域（DMR），表明PM2.5暴露（即使低劑量）可以調控睪丸甲基化。此外，甲基化組和轉錄組的聯合分析鑒定出一些關鍵甲基化基因和網絡，這些基因和網絡可能參與精子發生和類固醇激素的合成。關鍵基因尤其是Cyp11a1和Pax8的睪丸甲基化水平升高，隨后表達水平降低可能會損害睪酮和精子生成過程。本研究為DNA甲基化可能參與PM2.5誘導的男性生殖損傷提供了基礎知識和新見解。
圖形摘要
睪丸全基因組DNA甲基化組和轉錄組的聯合分析鑒定了與類固醇生成和精子發生過程相關的關鍵基因和通路，這可能是PM2.5引起的男性生殖障礙中DNA甲基化調控機制。
研究思路
材料方法
8周齡C57BL/6雄性小鼠，過濾空氣組（FA），未過濾空氣組（UA）和濃縮PM2.5 組(CAP)。FA組為高效顆粒空氣過濾器過濾的環境空氣，UA組為未經過濾的環境空氣，CAP組為細顆粒物（PM2.5）暴露環境空氣。
從小鼠眼眶叢中獲得血液，稱重睪丸和附睪，分別固定在Bouin溶液中進行形態學分析和在液氮中速凍-80°C儲存。
從睪丸組織中分離提取RNA、DNA和蛋白質進行全基因組重亞硫酸鹽測序 （WGBS）分析、轉錄組測序（RNA-seq）和Western Blot實驗，WGBS為每組構建兩個庫，每個庫包含來自四只小鼠的合并睪丸DNA。
圖1：PM2.5暴露表征
（A）PM2.5暴露程序示意圖。（B）實驗期間各組PM2.5濃度。（C） PM2.5中無機離子水平。（D）PM2.5中多環芳烴濃度。（E）PM2.5中痕量金屬（trace metal）濃度。研究結果
（1）PM2.5暴露導致精子質量下降和精子發生損傷
圖2：PM2.5暴露導致精子發生障礙
（B-C）在VII期曲細精管（n=15）中檢測曲細精管直徑（B）和上皮高度（C）的精子發生參數。
（D-H）每個VII期曲細精管的Sertoli細胞（D）、精原細胞（E）、粗線期精母細胞（F）、圓形精子細胞（G）和總生殖細胞（H）的計數（n=15）。
（I-L）精原細胞/Sertoli細胞比率（I）、粗線期精母細胞/Sertoli細胞比率（J）、圓形精母細胞/Sertoli細胞比率（K）、總生殖細胞/Sertali細胞比率（L）（n=15）。
單向方差分析，然后Tukey多重比較。與FA處理組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。
（2）PM2.5暴露誘發睪丸類固醇激素功能障礙
圖3：PM2.5暴露誘發睪丸內分泌功能障礙
（A-C）血清中的激素。睪酮(T)（A）、促黃體生成素(LH)（B）、卵泡刺激素(FSH)（C）的水平（D）血清T/LH在血清中的比值（D）（n=15）。
（E-G）睪丸水平，睪酮(T)（E）、LH（F）、FSH（G）（n=7）。
（H） 睪丸T/LH比值（n=7）。
（3）PM2.5暴露誘導睪丸全基因組低甲基化
圖4：PM2.5暴露改變了睪丸中的甲基化模式
（A） ELISA檢測到的睪丸DNA的全基因組5mC甲基化水平。（B） 基因組甲基化測序示意圖。
（C） 通過WGBS檢測睪丸基因組中所有CpG位點的全基因組DNA甲基化水平。
（D） 功能基因組區域mm10內5mC相對密度的基因組特征。
（E） PM2.5暴露組與FA組DMR鑒定。
（F和H） CAP組（F）和UA組（H）染色體上的顯著DMR。
（G和I） CAP組（G）和UA組（I）中鑒定的DMR基因組位置（啟動子、5’UTR、外顯子、內含子、3’UTR、基因間）（上：高DMR；下：低DMR）。
（J） DMR相關基因（DMG）生物過程的富集分析。點的顏色表示P值，點的大小是給定生物過程中的富集分數。
（4）基于DMR的功能相關基因
圖5：PM2.5誘導的啟動子相關DMR變化表征
（A） FA組、UA組和CAP組中啟動子連接的DMR相關基因（PDMG）熱圖。塊的顏色表示相對甲基化水平。紅色表示高甲基化，藍色表示低甲基化。（B） 與FA組相比，CAP組中PDMGs的最高生物過程（top biological process）氣泡圖。每個圓圈表示不同的生物過程，大小表示富集-sore。X軸表示總差異基因中高甲基化和低甲基化基因數量差異比例。氣泡越向右，表示通路中高甲基化基因比例就越高。
（C） 啟動子區域的DMG以及染色體位置的曼哈頓圖。X軸代表染色體。Y軸是-log10 FDR。
（D） DNA甲基化peaks可視化Meioc基因座。橙色表示DMR區域。
（5）PM2.5暴露破壞了睪丸的轉錄組特征
圖6：PM2.5暴露破壞睪丸的轉錄組學特征
（A） 實驗設計圖。（B） FA組、UA組和CAP組中DEG熱圖。
（C） DEG的KEGG分析。
（D） FA組和CAP組中類固醇激素生物合成過程基因組的GSEA分析。
（E） 睪酮生物合成通路分子圖。
（F） 與類固醇生成和精子發生相關的DEGs熱圖。塊的顏色表示每組的基因表達水平。
（6）DNA甲基化組和轉錄組聯合分析，鑒定與PM2.5暴露相關的關鍵甲基化基因
圖7：WGBS和RNA-seq圖譜聯合分析揭示了PM2.5誘導的睪丸損傷中候選表觀遺傳基因和網絡失調
（A）與類固醇生物合成和精子發生相關的候選功能基因的啟動子甲基化和表達水平熱圖。（B） 參與生殖功能的候選基因網絡。
（C） RT-PCR驗證睪丸中候選類固醇生成相關基因的mRNA表達水平（n=6）。
（D） RT-PCR驗證睪丸中候選精子發生相關基因的mRNA表達水平（n=6）。
（E） Cyp11a1基因DMR內代表性CpG甲基化譜。
（F） Pax8基因DMR內代表性CpG甲基化譜。
（G） western blot分析睪丸候選基因的蛋白表達水平。
（H） CYP11A1和PAX8的蛋白質定量分析（n=6）。
結論：
本研究表明PM2.5暴露可導致睪丸功能障礙，包括精子發生和類固醇激素功能障礙。作者揭示了PM2.5可以改變睪丸的甲基化水平，表明DNA甲基化可能參與PM2.5誘導的男性生殖損傷過程。睪丸全基因組DNA甲基化組和轉錄組的聯合分析鑒定了與類固醇生成和精子發生過程相關的關鍵基因和通路，這可能是PM2.5導致男性生殖障礙的DNA甲基化調控機制。本研究可能為PM2.5誘導男性生殖毒性的潛在表觀遺傳機制提供重要信息和新視角。
參考文獻：Zhang Z, Wang J, Shi F, Li Y, Zou P, Tang Y, Liu C, Wang Y, Ling X, Sun L, Liu C, Zhang Y, Gao F, Chen Q, Ao L, Han F, Liu J, Cao J. Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure. Environ Int. 2022 Sep 24;169:107544.
標簽：
DNA甲基化
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