本文要點：相較于近紅外一區（NIR-I, 650-900 nm），近紅外二區（NIR-II, 1000-1700 nm）窗口的光聲（Photoacoustic, PA）和熒光雙模態成像具有最大允許曝光高、自身熒光低和穿透深度大等優點而獲得了廣泛的關注。然而，由于缺乏合適的材料，在NIR-II激發下主動靶向膠質瘤的NIR-II PA/NIR-IIa（1300-1400nm）熒光成像卻少有報道。

本研究制備了一種靶向αvβ3的NIR-II光聲/NIR-IIa小分子熒光探針IR-32p，并使用U87MG荷瘤小鼠評價其成像效果。在1020/1064 nm激發下，在原位膠質瘤模型中表現出良好的腫瘤攝取、高靶向特異性等特殊的雙模成像特性，顯示出可穿透顱骨獲得優異的成像結果。本研究同時還證實了在體內NIR-II PA/FL成像中，NIR-II激發優于NIR-I。

將αvβ3整合素結合肽環cRGDfK與N3-PEG16-COOH的羧基端偶聯，生成N3-PEG16-cRGDfK，所得的加合物N3-PEG16-cRGDfK通過銅催化的疊氮化物-炔環加成的鍵合反應與5H5偶聯，就得到了化合物IR-32p。

IR-32p因與PEG連接而具有良好的水溶性，能在水溶液中自組裝形成穩定有序、尺寸分布均勻（d=10.0±3.0 nm）的球形膠束。IR-32p在水中的最大吸收波長為1094 nm，最大發射波長為1120 nm。同時在水中表現出強烈的NIR-I和NIR-II PA信號，且信號強度隨濃度的增加具有良好的線性關系，在800-890 nm處的強度比在1000-1100 nm處的強度高約30%。在不同培養基中幾乎保持了一致的熒光/PA強度，并顯示出優異的穩定性，這有利于體內外的長期跟蹤。

圖1. IR-32p的合成路徑、水中的光學性質、穩定性

由于IR-32p在NIR-I和NIR-II激發下均有強烈PA信號，作者進而比較了在NIR-I和NIR-II激發下，IR-32p成像的生物組織穿透深度。盡管隨著成像深度增加，兩種激發的PA成像信號背景比（SBR）均顯著降低。但相同條件下，NIR-II PA成像（1020nm激發）始終顯示出比NIR-I（800nm激發）更高的SBR。IR-32p在NIR-II窗口的最大穿透深度超過2cm，足以支持體內成像。

圖2. IR-32p穿透深度測試的實驗裝置及結果

IR-32p對體外細胞（U87MG和NIH/3T3）具低光毒性；即使5倍成像濃度也不會使小鼠主要器官引起器質性病變，不影響血常規及肝腎功能。總之，體內外安全性實驗均顯示IR-32p具有良好的生物相容性，這支持了作者進行小鼠體內膠質瘤成像。

圖3. IR-32p的體內外生物相容性

使用IR-32p進行皮下原位U87MG膠質瘤的體內NIR-IIa熒光成像，同時使用IR-32p+cRGDfK共注射作為阻斷組以評估IR-32p對整合素αvβ3受體的特異性（cRGDfK注射劑量為IR-32p的10倍以競爭αvβ3受體）。在3h時開始有明顯可區分的信號，強度在6h達到最大，比阻斷組高約2倍；而阻斷組腫瘤熒光信號在各時間點均有降低，其輕微的信號積累可能歸因于EPR效應。

另外，分別進行NIR-I和NIR-II激發下的體內PA成像，PA信號均在5 h時最強，且明顯高于阻斷組，與熒光成像一致；但在1020 nm處可觀察到更高的對比度。

以上結果說明了IR-32p具有出色的主動靶向能力，積累量高，可實現清晰、快速的腫瘤可視化。

圖4. 皮下原位膠質瘤NIR-II PA/NIR-IIa熒光成像

在出色的皮下成像質量的激勵下，作者研究了IR-32p對原位腦膠質瘤模型的雙模態成像能力。在U87MG正位腦膠質瘤小鼠模型中，IR-32p作用后3 h，腫瘤部位即可見清晰的熒光信號，6 h內熒光信號逐漸增強，達到超高對比度；并且在去除頭皮后，大腦和膠質瘤的形態更加清晰。這表明了IR-32p克服完整顱骨和頭皮屏障的深組織穿透能力。

離體生物分布研究發現IR-32p主要在肝臟、脾臟和腎臟中積累，表明了其肝臟和腎臟的清除途徑。離體腦圖像還進一步證實了IR-32p特異性靶向αvβ3的能力。

圖5. 原位腦膠質瘤NIR-II熒光成像

最后，利用NIR-II PA來評估腦膠質瘤的精確位置信息，充分說明了NIR-II 激發相較于NIR-I激發的優勢：當激發光從800 nm切換到1020 nm時，顱骨和頭皮的強信號幾乎消失；在NIR-II PA成像中，從膠質瘤中心點到顱骨的深度和高度可準確地測量，取得與MRI一致的結果；在代表性圖像中，NIR-II PA成像的腫瘤與正常組織之比（T/NT）約為NIR-I PA成像的8倍。

阻斷實驗中，24 h內未檢測到膠質瘤的明顯PA信號，驗證了IR32p對膠質瘤的主動靶向能力。根據H&E染色，IR-32p處理組和阻斷組膠質瘤的面積、大小和形態與MRI或NIR-II PA成像結果一致。這些結果進一步證實了NIR-II相對于NIR-I PA成像在原位膠質瘤成像中的優越性。

圖6. 原位腦膠質瘤NIR-I / NIR-II PA成像

總之，本研究合理設計并合成了小分子αvβ3靶向NIR-II PA/NIR-IIa探針IR-32p，用于NIR-II激發下膠質瘤的靶向成像。IR-32p的寬帶吸收使得NIR-I和NIRII的PA成像成為可能。IR-32p具有優異的生物相容性和優越的光物理性能，可在NIR-II激發下對U87MG皮下膠質瘤進行NIR-II PA/NIR-IIa熒光雙模成像，比NIR-I激發具有更深的穿透性和更高的腫瘤靶向對比度，使IR-32p成為未來臨床應用中深部原位腦膠質瘤檢測的有希望的候選者。

參考文獻

Lyu S, Lu S, Gui C, Guo C, Han J, Xiao Y, Zhang R, Hong X. A NIR-II Photoacoustic/NIR-IIa Fluorescent Probe for Targeted Imaging of Glioma under NIR-II Excitation. J Med Chem. 2024 Feb 8;67(3):1861-1871

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