結(jié)腸癌是成人癌癥相關死亡的主要原因之一。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）、KRAS 或 BRAF基因中存在激活突變和/或 T 細胞浸潤等特征均顯示與預后和/或治療反應相關。免疫治療的成功取決于免疫細胞對腫瘤的浸潤以及來自影響免疫細胞分化和功能的腫瘤微環(huán)境（TME）的信號。TME 由細胞外基質(zhì)（ECM）成分、內(nèi)皮細胞、免疫細胞和腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）組成，在確定腫瘤免疫細胞功能方面發(fā)揮重要作用。特別是CAFs，促進了結(jié)腸癌的發(fā)生，進展，轉(zhuǎn)移形成和治療耐藥性。當被腫瘤細胞激活時，CAFs 可能反過來促進腫瘤細胞的侵襲性行為。此外，CAFs 有助于免疫抑制性 TME 的產(chǎn)生。從功能上講，細胞外基質(zhì)（ECM）成分的持續(xù)沉積是 CAF 介導的關鍵特征，可影響侵襲性腫瘤細胞行為和免疫抑制的多個方面。

在結(jié)腸癌中，“間充質(zhì)型”共識分子亞型4（CMS4）的特征是 CAF 含量高和反映血管生成、炎癥和免疫抑制的基因表達程序。盡管 CMS4 MSI-L 結(jié)腸癌具有免疫抑制性質(zhì)，但已從此類腫瘤中分離出腫瘤特異性新抗原反應性 T 細胞。因此，提高 CMS4 結(jié)腸癌中腫瘤反應性 T 細胞的活性可能是一種很有前景的治療策略。新型治療策略的設計和測試需要用于研究CMS4（富含CAF）結(jié)腸癌的模型系統(tǒng)。為了揭示腫瘤細胞和CAFs之間的相互作用如何決定腫瘤行為，需要基于類器官的模型系統(tǒng)，其中兩種細胞類型以可重復和穩(wěn)健的方式共培養(yǎng)。

在荷蘭烏得勒支大學醫(yī)學中心以及鹿特丹伊拉斯謨大學醫(yī)學中心研究課題組的一項實驗中，該團隊提出了結(jié)腸癌類器官和CAFs在高度標準化的無血清培養(yǎng)基和優(yōu)化的ECM中的長期共培養(yǎng)模型。在這些條件下，腫瘤細胞和CAFs自發(fā)地組織成上層結(jié)構，同時使ECM變硬和收縮。上皮腺結(jié)構與CAF軌道直接接觸，與患者結(jié)腸腫瘤的組織學非常相似。單細胞轉(zhuǎn)錄組學分析進一步證明了共培養(yǎng)誘導的臨床相關腫瘤細胞和 CAF 表型的產(chǎn)生。兩種細胞類型都需要產(chǎn)生抑制T細胞增殖的免疫抑制環(huán)境。具體內(nèi)容發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Co-cultures of colon cancer cells and cancer-associated fibroblasts recapitulate the aggressive features of mesenchymal-like colon cancer”。

在共培養(yǎng)模型中，首先將小類器官接種在含有基質(zhì)膠和膠原蛋白I 的共培養(yǎng)基質(zhì)中,然后在共培養(yǎng)基中加入CAFs（圖1A）。在最初的2-3天內(nèi)，CAFs在含有類器官的基質(zhì)液滴周圍組織成一個連續(xù)的圓圈（圖1 B、C）。在液滴內(nèi)，CAFs組織成基質(zhì)軌跡，同時，類器官沿著這些CAFs軌跡重組。最終，所有單獨的類器官融合成一個圍繞 CAF 軌道的單個實體 （圖1 D），形成肉眼可見的“微型腫瘤”（圖1 E）。這些數(shù)據(jù)表明，在優(yōu)化條件下與腫瘤細胞共培養(yǎng)CAFs會導致自發(fā)的ECM重組和類似腫瘤組織的上層結(jié)構的組裝。目前尚不清楚是什么原因?qū)е铝思毎�重組。

圖1 腫瘤細胞和CAFs自發(fā)重組成宏觀微型腫瘤。

接下來，實驗旨在從機制上深入了解 CAFs 和腫瘤細胞如何相互影響彼此的表型以誘導 ECM 重塑和細胞重組。為此，通過FACS分選對單培養(yǎng)（CAF-2d、CAF-3d、類器官）和共培養(yǎng)（CAF/類器官）分離的兩種細胞類型進行了單細胞RNA測序。總共分析了 949 個細胞，確定了3 個腫瘤細胞群（clusters 1-3）和 3 個CAF 群（clusters 4-6）。腫瘤細胞與 CAFs 共培養(yǎng)導致 cluster-2 細胞減少，而 cluster-3 細胞強烈擴增。為了深入了解不同腫瘤細胞群和CAFs之間的表型差異，進行了差異基因表達分析。Cluster-1 腫瘤細胞的特征是缺氧和糖酵解相關基因的表達，Cluster-2由95%的單培養(yǎng)腫瘤細胞組成，增殖相關基因表達最高，Cluster-3 腫瘤細胞主要由共培養(yǎng)的腫瘤細胞組成，上皮基因（KRT19、EPCAM、CDH1）表達較低，間充質(zhì)基因（SPARC、TIMP1、VIM、MMP2）和基因集（Hallmark EMT）表達較高，反映了（部分）上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （EMT）。此外，CMS4 識別基因集（CMS2 RF）（主要由 CAF 表達的基因組成）在 Cluster-3 中表達水平顯著更高。這些分析表明，共培養(yǎng)中腫瘤細胞和 CAFs 之間的相互作用誘導腫瘤細胞的表型轉(zhuǎn)變，從上皮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀?間充質(zhì)混合狀態(tài)，如在 CMS4 結(jié)腸癌中觀察到的那樣。

然后分析在單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)中生長的CAFs之間的表型差異。Cluster 4 從單一培養(yǎng)物中分離的 CAF 組成，Cluster 6 從共培養(yǎng)物中分離的 CAF 組成，Cluster 5 由來自單一培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物的 CAF 組成（圖2 A）。差異基因表達分析顯示，Cluster 6 中多種細胞外基質(zhì)基因的表達發(fā)生了變化，包括COL1A1的下調(diào)，COL4A1和COL4A的上調(diào)（圖2 B）。CAFs表達了非常高水平的膠原交聯(lián)酶LOX和膠原裂解酶MMP1。使用免疫熒光分析表明CAF產(chǎn)生的膠原蛋白-4形成了與腫瘤細胞相互作用的基底膜狀網(wǎng)狀結(jié)構（圖4 C）。此外，與單培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)CAFs中反映缺氧和缺氧誘導因子1-α靶點的基因集顯著更高（圖2 D），進一步的分析表明，與腫瘤細胞共培養(yǎng)誘導了 CAF 代謝的重大轉(zhuǎn)變，參與糖酵解的基因表達增加（圖2 E），免疫熒光分析表明共培養(yǎng)CAFs中LDHA和 GAPDH 的表達顯著升高（圖2 F、G）。這些數(shù)據(jù)說明，共培養(yǎng)的 CAFs 獲得缺氧、糖酵解和基質(zhì)重塑表型。

圖2 共培養(yǎng)的 CAFs 獲得缺氧、糖酵解和基質(zhì)重塑表型。

目前根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學特征和結(jié)直腸癌細胞的異質(zhì)性對結(jié)直腸癌進行分型，定義了四種不同的結(jié)直腸癌亞型（CMS1-CMS4）。為了研究單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)中的 CAF 表型是否與人類結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的 CAF 表型相似，實驗利用了來自 29 名患者的原發(fā)性結(jié)腸腫瘤的大型單細胞 RNA 序列數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)表明，共培養(yǎng)中的 CAFs 類似于在人類CMS1和CMS4結(jié)腸癌中富集的具有缺氧糖酵解表型的CAFs亞群。

上述共培養(yǎng)的幾個特征先前與癌癥中的免疫抑制有關，包括ECM硬化，缺氧和糖酵解代謝。基因表達分析顯示，共培養(yǎng)（Cluster-6）中的CAFs表達非常高水平的免疫抑制基因，包括CXCL8、PTGS2、TGFB1和VEGFA （圖3 A）。對單一培養(yǎng)或共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的分析表明，共培養(yǎng)比單一培養(yǎng)通常分泌更高水平的TGFβ1（圖3 B）、VEGFA （圖3 C）和乳酸（圖 3 D、E），這表明產(chǎn)生了潛在的免疫抑制環(huán)境。

實驗發(fā)現(xiàn)與不同CAF系共培養(yǎng)的細胞中分泌因子的數(shù)量存在差異，例如CR16CAF比LCAF5分泌更高水平的TGFB1，這反映了CAFs的異質(zhì)性。最后，為了直接測試免疫抑制潛力，分析了條件培養(yǎng)基對從四個不同供體中分離的 T 細胞活化的影響。從CAF或腫瘤細胞單培養(yǎng)中分離的培養(yǎng)基分別對T細胞增殖無抑制作用和有中等抑制作用。相比之下，從 CAF/腫瘤細胞共培養(yǎng)中分離的培養(yǎng)基在所有四種情況下均有效抑制 T 細胞增殖（圖3 F、G）。這些數(shù)據(jù)表明，CAFs和腫瘤細胞共培養(yǎng)引起的部分表型變化，導致了免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生。

圖3 共培養(yǎng)中免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生。

一般來說，特異性器官微環(huán)境對遠端轉(zhuǎn)移的免疫環(huán)境的影響及其對免疫檢查點阻斷的反應是免疫腫瘤學研究的一個重要主題。該報告中開發(fā)的共培養(yǎng)模型系統(tǒng)通過合理添加特定的細胞類型和/或細胞因子和/或細胞外基質(zhì)成分，可以開始對器官特異性微環(huán)境進行建模，以評估它們對T細胞行為的影響。類器官和永生化 CAFs 的共培養(yǎng)概括了侵襲性間充質(zhì)型人結(jié)直腸癌的組織學、生理學和免疫抑制特征。該模型可用于研究免疫抑制的機制，并測試針對CAFs和腫瘤細胞之間串擾的治療策略，也可以進一步修改以代表不同的結(jié)腸癌亞型和（器官特異性）微環(huán)境。最終，這將有助于開發(fā)涉及免疫療法的新型聯(lián)合治療策略。

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原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37261365/

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