一、分光光度法測定物質含量時應注意的事項:
1、是顯色反應的條件
2、是測量吸光度的條件。顯色反應的條件有：顯色劑的用量 、顯色時間、干擾物質的消除方法、介質的酸度、顯色時溶液的溫度等。測量吸光度的條件包括應選擇的入射光波長，吸光度范圍和參比溶液等。 
紫外分光光度計法測定微量鐵的顯色劑可以選擇鄰二氮菲(phen)在pH=2～9的條件下，Fe2+離子與鄰二氮菲生成穩定的橘紅色絡合物，反應如下：
此絡合物lgK穩=21.3，摩爾吸光系數。
顯色前，要用鹽酸羥胺把Fe3+離子還原為Fe2+離子：
測定時應控制溶液酸度在pH=5左右為宜，酸度太高，反應進行較慢，酸度太低，Fe2+離子水解，影響顯色。
 
二、試劑和儀器
儀器：UV-1500PC
試劑 ： 1、100鐵標準溶液
 2. 10鐵標準溶液由100稀釋制得
3.鹽酸羥胺10%溶液   
4.鄰二氮菲溶液0.15%  
5.NaAc溶液1mol/L
 
三、 實驗步驟 
1、測量波長的選擇
在50ml容量瓶中按次序準確加入以下溶液，10鐵標準溶液5ml，10%鹽酸羥胺1ml，搖勻，再加入1mol/LNaAc溶液5ml，0.15%鄰二氮菲3ml。用水稀釋至刻度。在分光光度計上，用1cm比色皿以水為參比溶液，測定其在440～580nm之間的吸光度。并繪制圖，從曲線上找出大吸收的波長。

2、顯色劑用量的選擇
  取7個50ml容量瓶，各加入1ml10鐵標準溶液，1ml鹽酸羥胺，搖勻。再分別加入0.10、0.30、0.50、0.80、1.0、2.0、4.0ml鄰二氮菲和5mlNaAc溶液，以水稀釋至刻度，搖勻，放置10min。以水為參比溶液，在選擇的波長下測定各溶液的吸光度。并繪制,從曲線上找出顯色及的適宜用量V。

3、顯色時間的選擇
  在1個50ml容量瓶中，加入1ml10鐵標準溶液，1ml鹽酸羥胺，再加入由上述選擇的適宜鄰二氮菲Vml，5mlNaAc，以水稀釋至刻度，搖勻。立刻用比色皿以水為參比在選擇的波長下測量吸光度。然后依次測定放置5、10、30、60min后的吸光度。繪制圖，選出與鄰二氮菲顯色反應所需的適宜時間。

4.標準曲線的繪制
  在6個50ml容量瓶中，分別加入0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml 10鐵標準溶液，再分別加入1ml鹽酸羥胺，2ml鄰二氮菲，5mlNaAc溶液，用水稀釋至刻度，搖勻。以水為參比溶液在選擇的波長 、選擇的適宜顯色劑用量、適宜顯色時間下測定各溶液的吸光度。繪制標準曲線圖。
數據記錄與處理
 
1.測量波長的選擇

由上圖知，適宜波長為=510nm

2.顯色劑用量的選擇
顯色劑體積V/mL

由上圖知，適宜指示劑用量為V=1.0ml

3.顯色時間的選擇

由上述圖知，直線斜率K=1.0×10-4≈0，故可認為顯色時間對吸光度幾乎無影響。

4.標準曲線的繪制
鐵標準溶液體積v/mL