期刊：Nano Today
影響因子：17.4
伯豪產品服務：mRNA-seq

導讀
皮膚缺損區毛囊的再生仍然是世界各地的一個巨大挑戰。由于毛囊采集困難，目前還沒有有效的策略來解決這一問題。在此，作者設計了一種基于鉬酸鈣（CM）納米顆粒的生物墨水，其中含有真皮乳頭細胞（DPCs）和巨噬細胞。通過釋放鉬（Mo）離子，建立了一個抗炎的微環境，從而實現了對生物活性離子介導的毛發再生的良好免疫調節。研究表明，在含有CM納米顆粒的多細胞生物墨水中，Mo將巨噬細胞極化為M2表型，從而抑制抗炎細胞因子。此外，該支架的抗炎免疫微環境誘導DPCs分泌毛囊生長原相關細胞因子，促進體內毛發再生。最后，轉錄組學分析揭示了Mo激活巨噬細胞中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路并上調生長因子（HGF和IGF-1）的表達的潛在機制。通過裸鼠創面、皮下植入和小鼠的雄激素脫發三種動物模型證實了該支架的免疫調節和誘導毛發再生作用。

研究技術
mRNA-seq

技術路線圖

研究結果
1.含鉬酸鈣（CM）納米顆粒生物墨水的制備和細胞活性
開發了一種具有毛囊再生功能的新型生物墨水，將CM納米顆粒與不同濃度的GG（gelatin + GelMA）基質生物墨水混合，制備生物墨水。本研究采用DPCs和巨噬細胞（RAW 264.7 cells），研究免疫調節對毛發再生的機制。隨著培養時間的延長，細胞生長良好并增殖。同時研究了單培養支架中DPCs的基因相對表達水平（圖1c）。PDGF-A、PDGF-B、C-Myc、VEGF的表達跟0CM-GG-D組相比，50CM-GG-D組、250CMGG-D組和500CM-GG-D組上調。PDGF已被證明在卵泡發育和血管生成中至關重要。PDGF-A和PDGF-B作為PDGF家族的兩個主要成員，可以誘導和維持頭發循環的生長期。綜上所述，CM有利于DPCs毛囊生相關基因的表達。

為了研究CM納米顆粒介導的免疫環境，將RAW 264.7細胞加入到生物墨水中，制備了一系列支架。培養21天后，RAW 264.7細胞在含50和250 μg/mL CM的單培養支架中的增殖作用明顯高于無CM的支架。（圖1d)。對支架中的RAW 264.7細胞進行分離、收集，并進行免疫染色，分析CD206的表達情況。與0CM-GG-D組相比，50CM-GG-D、250CM-GG-D和500組CD206的熒光強度明顯上調。其中，250CM-GG-D組的CD206表達最強�；�因分析的結果與免疫熒光染色圖像一致這些結果表明，CM能夠觸發更多的M2巨噬細胞標記物和抗炎細胞因子的產生，顯示出CM在刺激巨噬細胞向抗炎M2表型方面的顯著有效性。
 

2. 生物打印多細胞支架對細胞行為的調節作用
將CM納米顆粒加入到濃度為250 μg/mL（250CM-GG）的生物墨水中，之后將DPCs和RAW 264.7細胞分別加入到生物墨水中。接下來，打印了一系列不同細胞比例的多細胞支架：RAW 264.7細胞數量為DPCs細胞數量的1/2（Co-D-1/2 R）、1/3（Co-D-1/3 R）和1/5（Co-D-1/5 R）。選擇僅含DPCs的支架作為對照組（Mono-D）。在培養7天后，檢測支架中細胞的相關基因表達情況。PDGF-A、PDGF-B、C-Myc和VEGF的表達明顯高于Mono-d組。生長因子，如肝細胞生長因子（HGF）和胰島素樣生長因子-1（IGF-1），在脫發治療中發揮了重要作用，因此，還檢測了RAW 264.7細胞在多細胞支架中的HGF和IGF-1基因的表達。發現Co-D-1/3 R誘導了良好的免疫微環境，從而促進了分泌與促進毛囊再生相關的細胞因子。
 

3. CM誘導免疫調節作用的作用機制
為了探討Mo離子對巨噬細胞免疫調節作用的潛在機制，分別制備了僅含有RAW 264.7細胞（簡稱3D-R-control）和同時含有RAW 264.7細胞和CM的3D支架（簡稱3D-R-CM）。培養7天后進行轉錄組測序。主成分分析（PCA）顯示，差異基因表達與CM的存在與否顯著相關，提示RAW 264.7細胞的基因表達可以被CM的支架調控。比較了兩組差異表達基因（DEGs），熱圖和火山圖顯示，3D-R-CM中有756個上調基因和1638個下調基因，表明基因表達差異范圍廣泛。然后，進行GO分析，探討其生物學功能可能會影響細胞凋亡和巨噬細胞分泌生長因子等生物過程等。對DEGs進行KEGG富集分析，mTOR、PPAR信號在上調的通路，已被證實與M2表型激活有關。相反，M1表型激活相關通路如TNF和MAPK信號通路在下調的通路中。

CM的加入可顯著促進M2表型相關基因和毛囊生長期相關基因。加入mTOR抑制劑后，基因表達水平下調到未加入CM的對照組。RAW 264.7細胞中IRS1、PI3K、mTOR、Rho和ROCK2的基因表達受到CM刺激的正調控，這些關鍵分子表明了mTOR通路的激活。因此，Mo離子激活的mTOR信號通路在免疫調節性毛發再生中起到了重要作用。
 

4. 生物打印多細胞支架對體內毛囊再生和傷口愈合的影響
首先研究了該支架對裸鼠皮膚缺損模型中創面愈合和毛囊再生的影響。將這些支架移植到裸鼠的急性皮膚創面（10 mm）上。將裸鼠隨機分為5組：無支架（Blank）、不含DPCs和CM的支架（GG）、僅含DPCs的支架（GG-D）支架、含CM和DPCs的支架（CM-GG-D）、含CM、DPCs和RAW 264.7細胞的支架（CM-GG-Co、DPCs和RAW 264.7細胞，比例為3：1）。14天內不同時間點的創面宏觀照片和創面面積統計圖，說明GG-D、CM-GG-D、CM-GG-Co組均表現出良好的創面愈合效果。空白組在第14天顯示未完全上皮化，明顯未愈合的缺損。特別是CM-GG-Co組的創面缺損完全閉合。體外實驗結果表明，含CM的支架可誘導M2巨噬細胞極化，并在傷口周圍建立抗炎微環境。當小鼠飼養到40天時，CM-GG-D和CM-GG-Co處理的小鼠背部有新生毛發，而Blank組、GG組和GG-D組沒有毛發。值得注意的是，與CM-GG-D組相比，CM-GG-Co組實現了更多的毛囊和毛發再生。提示RAW 264.7細胞與DPCs相互作用所誘導的治療效果優于單獨作用的DPCs。

為了研究CM的免疫調節作用，對生物3D打印進行了皮下植入。ELISA檢測第4天和第7天支架周圍組織中TNF-a、IL-4、KGF、PDGF-A和C-Myc的分泌水平。與預期的一樣，用含有CM的支架（CM-GG-D和CM-GG-Co）處理的組織在第4天和第7天分泌的促炎細胞因子TNF-a要少得多，但分泌的抗炎IL-4更多。用含有DPCs的支架處理的組織在第4天分泌了更多的KGF、PDGF-A和C-Myc。與第4天相比，ELISA結果在第7天有更明顯的變化趨勢。

為進一步證實毛囊再生效果，并通過肉眼觀察毛發再生情況，建立了雄激素性脫發（AGA）小鼠模型。同樣，AGA小鼠隨機分為5組：無支架（Blank）、無DPCs和CM的支架（GG）的支架、含DPCs和RAW 264.7細胞（GG-Co）的支架、含CM的支架（CM-GG）、含CM、DPCs和RAW 264.7細胞的支架（CM-GG-Co、DPCs和RAW 264.7細胞，比例為3：7）。隨著時間的推移，毛發再生狀態的視覺外觀顯示，Blank組和GG組直到第40天才沒有明顯的新生毛發，而其他組，特別是CM-GG-Co處理的小鼠再生了大量的毛發，CM-GG-Co獲得了最顯著的再生毛發覆蓋度。CM-GGCo組在細胞增殖、毛囊形成和毛發再生等各個階段均表現出明顯的優勢�？偟膩碚f，所獲得的含有CM的多細胞支架具有免疫調節和體內毛發再生的能力，這是重建復雜皮膚附件的新策略的重大進展。
 

參考文獻：
Jinfu Wu, Jingge Ma, Hui Zhuang et al.3D bioprinting of calcium molybdate nanoparticles-containing  immunomodulatory bioinks for hair regrowth.[J] .Nano Today, 2023,101917.