細胞增殖檢測-軟瓊脂克隆實驗操作流程和注意事項
軟瓊脂克隆實驗
軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實驗(Anehorage-independentassay），利用軟瓊脂為培養介質，使細胞在懸浮狀態下生長。
軟瓊脂克隆形成實驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。
細胞克隆形成率表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量，主要反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。
Part 01. 實驗材料
Part 02. 實驗操作流程
1. 提前配置1.2%和0.7%瓊脂（Agarose 加蒸餾水配置），高壓滅菌后4攝氏度冰箱保存。鋪板當天微波爐或烘箱加熱融化，置于37攝氏度培養箱中。
2. 鋪下層膠：按1：1比例混勻1.2%Agarose和20%1640，6孔板每孔取2毫升混合液，在室溫條件下等待冷卻凝固。
3. 取對數生長期細胞，消化配置成單細胞懸液，計數后將細胞數調整為5*10^4/毫升。
4. 鋪上層膠：按1：1比例使0.7%Agarose和20%1640培養基混勻，取2毫升混合液于EP管中，向管中加入10-20微升細胞懸液，充分混勻后加入已鋪下層膠的6孔板中，待上層瓊脂凝固后，放在37攝氏度培養箱中培養2-3周，每三天向孔板中加入200微升培養基。
5. 顯微鏡下拍照，統計克隆直徑并作圖。
常見問題與解答
Q：細胞密度為多少合適？
A：細胞接種密度與最終實驗結果密切相關，若細胞太多，形成克隆數目太多，處理結果時數克隆不僅容易出錯，而且圖片很難看（下圖左）。細胞太少，不能形成克隆。如下圖所示：
上圖我們看到3株癌細胞在6孔板克隆形成圖片，第一個明顯鋪板細胞太密集，導致難以統計數據；中間那個正好，最后面那個細胞數量偏少，且細胞鋪板不均勻。因此，為了獲得美觀的圖片和準確的數據，第一次實驗最好設置細胞接種梯度，如500-1000-2000-5000個/孔挑選出最合適的接種密度。細胞在進行克隆形成實驗時要求有95%以上的分散度，否則結果的準確度會受到很大影響；另外注意細胞計數時建議多計數幾次。
Q：細胞接種后培養的時間，如何確定？
A：通常情況下，單個細胞在體外增殖6代以上所組成的細胞群稱為一個陽性克隆，時間約為一周；但具體時間因細胞增殖能力而已異，因此應密切關注細胞生長情況，隔天在顯微鏡下觀察克隆情況，若單個克隆細胞數到達50個左右即可固定細胞。
A：若鋪板不均勻，細胞稀的地方形成的克隆少，而密的地方克隆多，一方面影響統計結果，并且拍出的圖片不美觀。
Q：細胞未形成克隆的原因？
A：并非每種細胞都可以形成克隆，克隆形成率與細胞本身增殖能力有關。還與接種細胞密度，加入培養液的體積、血清濃度有關。因該實驗處理時間較長，應給細胞多加培養基，如每孔4ml，或者3天更換一次培養基，以供給細胞充足的營養。
Q：計數時克隆數目較多，有什么快捷辦法？
A：只要細胞鋪板均勻，我們可以選擇分區計數，取平均數。
注意事項
1. 細胞一定要吹打分散成單細胞懸液
2. 接種時細胞密度不可過高
3. 軟瓊脂與細胞混合時溫度不可過高，容易燙傷甚至燙死細胞。
4. 軟瓊脂對熱和酸不穩定，反復加熱容易降解并產生毒性，且容易造成硬度下降，因此需要高壓滅菌后進行分裝。
5. 鋪板操作時速度要快，以免造成局部凝固。
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