振蕩剪切應力調節Notch介導的腦動靜脈畸形內皮間充質可塑性
動靜脈畸形 （AVMs） 是由供血動脈和引流靜脈之間的直接連接引起的局部血管異常，沒有中間毛細血管網絡。腦部動靜脈畸形可導致廣泛的器官損傷，繼發于癲癇和自發性顱內出血。然而，由于腦AVMs（cAVMs）病灶的復雜血管特性，該疾病的分子發病機制尚未確定。
最近的研究發現，內皮到間充質轉化（EndMT）可導致AVM病灶的形成。EndMT過程與內皮細胞對間充質標志物的表達有關，表現為EC的增殖和侵襲、EC連接紊亂和形成梭形狀。然而，EndMT的潛在機制和觸發因素是模糊的。Notch信號通路是一種重要的生物學通路，它將血流動力學機械信號與生化信號級聯聯系起來，并決定細胞命運。值得注意的是，增強和減弱的Notch信號通路都與動靜脈分流的發展有關。由于直接動靜脈分流和病灶形成，AVMs的血流動力學發生高度改變。血流紊亂已被證明對血管內皮層有深遠影響。鑒定響應擾動流而觸發 EndMT 的調節分子可能為治療 cAVM 的藥理學方法提供新的見解。
在印度拉吉夫甘地生物技術中心、Sree Chitra Tirunal醫學科學和技術研究所等研究團隊的一項最新研究中，觀察到人類cAVM病灶中存在活化的Notch受體和EndMT標志物，還發現AVM病灶樣品中細胞粘附分子的失調。使用體外流體模型，該研究為內皮細胞中剪切應力-Notch3-EndMT軸的改變提供了證據。Notch信號在感知剪切應力波動和將細胞編程成間充質特征方面起著關鍵的中介作用，他們發現剪切應力誘導的細胞侵襲性改變需要活躍的Notch信號。此外，還探討了γ-分泌酶抑制劑（GSI）、DAPT和RO4929097在剪切應力改變的情況下預防Notch誘導的EndMT和細胞侵襲的效用。
cAVM病灶中EndMT和細胞粘附標志物的失調
早期研究表明，cAVM病灶的主要血管具有動脈、靜脈、毛細血管以及內皮標志物。經歷間充質轉化的內皮細胞表現出改變的形態特征，隨后間充質蛋白如轉凝蛋白（SM22-α）、鈣調蛋白等增加。實驗觀察到，在mRNA轉錄本水平上，SNAI1、Slug（SNAI2）、轉凝蛋白（TAGLN）和鈣調蛋白1（CNN1）在cAVM樣本中高表達。與對照相比，SNAI2在cAVM中的表達比SNAI1更突出（圖1 A）。
在EndMT過程中，內皮細胞和基底膜的細胞-細胞和細胞-ECM粘附將被破壞。這些分子變化促進了內皮細胞的侵襲性。因此，研究了cAVM病灶中鈣粘蛋白和整合素等粘附因子的表達。VE-鈣粘蛋白（CDH5）在患者樣本中下調，而cAVMs中的N-鈣粘蛋白（CDH2）mRNA上調。整合素α9亞基（ITGA9）mRNA在cAVMs中過表達，但整合素β1（ITGB1）mRNA降低。
此外，在AVM和對照組織中進行了基于免疫組織化學染色的EndMT蛋白表達和定位分析。實驗觀察到在AVM大血管的內膜區域存在SNAI1/2的過表達（圖1 B）。 SNAI1/2在對照腦血管系統中不表達。與對照組相比，nidal樣本中的SNAI1/2增加了約4倍（圖1 C）。鈣調蛋白1和轉凝蛋白在 cAVM 血管巢的內膜和中膜中均強烈表達。轉凝蛋白表達存在于對照組的小血管中，但鈣調蛋白1在對照血管系統中不表達。
N-鈣粘蛋白定位于病灶組織的新生內膜區域，在對照標本中未觀察到。也沒有在任何患者樣本的內層中觀察到N-鈣粘蛋白。與對照血管系統相比，發現整合素的活化形式α9/β1在cAVM病灶中下調。
腦動靜脈畸形表達更高水平的NICD3和NICD4
實驗最初研究了cAVM病灶中所有四個Notch受體基因Notch 1-4的表達，發現Notch3和Notch4 mRNA在病灶標本中顯著過表達。然后專門研究了激活的Notch受體的表達，即cAVM組織切片和對照腦樣本中的Notch細胞內結構域（NICD）。NICD3被發現高度表達并定位于血管巢的內膜和中膜，表明EndMT。cAVM中的NICD4受體水平較低，并且呈彌散模式，更靠近內膜，較少在中膜分布。蛋白質印跡分析進一步證實了AVM病灶中NICD3的表達升高。
振蕩流促進 γ-分泌酶依賴性 Notch 受體的激活
為了確定內皮細胞中是否發生振蕩剪切應力依賴性Notch受體活化，實驗使用流動室在暴露于規定流動條件下的hCMECs中進行基于qRT-PCR的mRNA分析和蛋白質免疫熒光測定，分析了暴露于平行剪切應力（15 dyn/cm2）24 h的hCMECs中的基因表達譜。結果發現，Notch1-4在平行單向流動條件下的mRNA表達與靜態流動條件下的表達沒有顯著差異（圖2 A）。與靜態相比，振蕩流（15 dyn/cm2）誘導內皮細胞中Notch3（4.11倍）和Notch4（2.06倍）mRNA的過表達。與暴露于平行流的細胞相比，振蕩流分別導致Notch3和Notch4增加了3.2倍和1.96倍。與靜態條件相比，平行流和振蕩流均未在hCMECs中誘導顯著的Notch1和Notch2表達（圖2 A）。
接下來，研究了暴露于各種流動條件的 hCMECs 中的 NICD 1、3 和 4 蛋白水平表達及其細胞定位。與平行流和靜態條件相比，暴露于振蕩剪切應力的內皮細胞中存在NICD3的過表達。振蕩剪切應力通過促進NICD3的核定位改變了Notch3受體的亞細胞定位。還發現細胞在24小時后以紡錘狀形態拉長。NICD4表達略有升高，但定位主要是細胞質。NICD1在三種流動條件下的細胞中均未顯著表達，但MFI分析表明暴露于振蕩流的細胞中略有過表達（圖2 B、C）。
此外，還研究了振蕩剪切應力是否通過誘導γ分泌酶活性直接誘導Notch受體激活，用0.5µM DAPT和250 nM RO4929097對暴露于振蕩流24 h 的hCMECs進行處理。兩種抑制劑都對hCMECs中γ-分泌酶誘導的Notch3受體的剪切應力反應產生了負面影響（圖2 D）。然而，RO4929097更具有統計學意義（圖2 E）。蛋白質印跡分析進一步證實了暴露于振蕩流的細胞中NICD3蛋白水平表達升高（圖2 F）。
振蕩流誘導的 EndMT 需要 Notch 受體激活
hCMECs被用來研究振蕩剪切應力下內皮標志物的喪失和間充質特征的增強。mRNA表達分析顯示，與靜態相比，暴露于振蕩剪切應力的細胞中間充質CNN1和TAGLN上調。關鍵的EndMT標記物SNAI1和SNAI2的mRNA在振蕩流暴露細胞中也分別過表達3.59倍和3.83倍（圖3 A）。在暴露于振蕩流的細胞中，與SNAI1相比，Slug表達略高，證實了cAVM中的發現。
對暴露于靜態、平行和振蕩剪切應力的hCMECs中的SNAI1/2進行免疫熒光分析。與其他流動狀態相比，SNAI1/2 在振蕩流的細胞中過表達并定位于細胞核（圖3 B）。MFI分析表明，與靜態流和平行流相比，SNAI1/2表達分別增加了3.8倍和3.1倍（圖3 C）。
為了評估hCMECs中Notch通路在剪切應力誘導的EndMT中的參與，在振蕩流過程中使用了GSI DAPT（0.5μM）和RO4929097（250 nM），并監測EndMT因子的表達。在振蕩應力期間SNAI1/2在DAPT和RO4929097 下分別降低了約60%和80%，而抑制Notch受體切割消除了此影響（圖4 A、B）。這些數據表明，振蕩剪切應力誘導的EndMT需要Notch 信號。γ-分泌酶抑制劑RO4929097在改變流動條件下減少內皮細胞的間充質表型非常有效。
RO4929097促進細胞粘附并減少暴露于振蕩流細胞的侵襲性
為了證實cAVM組織中細胞粘附因子失調的發現，通過qRT-PCR研究了暴露于各種流動條件的內皮細胞中內皮VE-鈣粘蛋白，間充質N-鈣粘蛋白和整合素亞基α9和β1的基因的mRNA表達。在暴露于振蕩剪切應力的細胞中N-鈣粘蛋白和整合素α9上調，而VE-鈣粘蛋白和整合素β1下調（圖3 A）。
暴露于剪切應力條件的細胞中這些粘附因子的免疫熒光測定表明，與暴露于靜態和平行剪切應力的細胞相比，振蕩剪切應力下的細胞中N-鈣粘蛋白上調。在暴露于振蕩流24 h 的細胞中發現激活的整合素α9/ β1顯著降低（圖3 B、C）。
DAPT和RO4929097顯著降低了暴露于持續振蕩流的細胞中的N-鈣粘蛋白。有趣的是，在DAPT和RO4929097 存在下，整合素α9/ β1表達分別增加了45.5%和56.7%（圖4 A、B）。
細胞侵襲性增加是EndMT的一個重要結果。為了研究hCMECs在流動狀態下的侵襲特性，使用Matrigel跨膜侵襲測定。先前將細胞暴露于振蕩剪切應力24小時誘導內皮侵襲性增加，DAPT和RO4929097均基本阻斷了內皮細胞的侵襲性（圖4 C）。與DAPT相比，RO4929097有效防止細胞侵襲（圖4 D）。這一發現表明，靶向Notch信號通路的藥物干預可以有效降低血流誘導的血管內皮細胞侵襲能力和EndMT。
總之，該研究表明，在人類cAVM病灶中存在Notch受體和EndMT標志物。這是第一份報告，表明改變的血流誘導的Notch信號導致cAVMs中的EndMT，提供了Notch信號在內皮細胞暴露于干擾流中增強細胞侵襲性的直接作用的證據。
參考文獻：Karthika CL, Venugopal V, Sreelakshmi BJ, Krithika S, Thomas JM, Abraham M, Kartha CC, Rajavelu A, Sumi S. Oscillatory shear stress modulates Notch-mediated endothelial mesenchymal plasticity in cerebral arteriovenous malformations. Cell Mol Biol Lett. 2023 Mar 18;28(1):22. doi: 10.1186/s11658-023-00436-x. PMID: 36934253; PMCID: PMC10024393.
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最近的研究發現，內皮到間充質轉化（EndMT）可導致AVM病灶的形成。EndMT過程與內皮細胞對間充質標志物的表達有關，表現為EC的增殖和侵襲、EC連接紊亂和形成梭形狀。然而，EndMT的潛在機制和觸發因素是模糊的。Notch信號通路是一種重要的生物學通路，它將血流動力學機械信號與生化信號級聯聯系起來，并決定細胞命運。值得注意的是，增強和減弱的Notch信號通路都與動靜脈分流的發展有關。由于直接動靜脈分流和病灶形成，AVMs的血流動力學發生高度改變。血流紊亂已被證明對血管內皮層有深遠影響。鑒定響應擾動流而觸發 EndMT 的調節分子可能為治療 cAVM 的藥理學方法提供新的見解。
在印度拉吉夫甘地生物技術中心、Sree Chitra Tirunal醫學科學和技術研究所等研究團隊的一項最新研究中，觀察到人類cAVM病灶中存在活化的Notch受體和EndMT標志物，還發現AVM病灶樣品中細胞粘附分子的失調。使用體外流體模型，該研究為內皮細胞中剪切應力-Notch3-EndMT軸的改變提供了證據。Notch信號在感知剪切應力波動和將細胞編程成間充質特征方面起著關鍵的中介作用，他們發現剪切應力誘導的細胞侵襲性改變需要活躍的Notch信號。此外，還探討了γ-分泌酶抑制劑（GSI）、DAPT和RO4929097在剪切應力改變的情況下預防Notch誘導的EndMT和細胞侵襲的效用。
cAVM病灶中EndMT和細胞粘附標志物的失調
早期研究表明，cAVM病灶的主要血管具有動脈、靜脈、毛細血管以及內皮標志物。經歷間充質轉化的內皮細胞表現出改變的形態特征，隨后間充質蛋白如轉凝蛋白（SM22-α）、鈣調蛋白等增加。實驗觀察到，在mRNA轉錄本水平上，SNAI1、Slug（SNAI2）、轉凝蛋白（TAGLN）和鈣調蛋白1（CNN1）在cAVM樣本中高表達。與對照相比，SNAI2在cAVM中的表達比SNAI1更突出（圖1 A）。
在EndMT過程中，內皮細胞和基底膜的細胞-細胞和細胞-ECM粘附將被破壞。這些分子變化促進了內皮細胞的侵襲性。因此，研究了cAVM病灶中鈣粘蛋白和整合素等粘附因子的表達。VE-鈣粘蛋白（CDH5）在患者樣本中下調，而cAVMs中的N-鈣粘蛋白（CDH2）mRNA上調。整合素α9亞基（ITGA9）mRNA在cAVMs中過表達，但整合素β1（ITGB1）mRNA降低。
此外，在AVM和對照組織中進行了基于免疫組織化學染色的EndMT蛋白表達和定位分析。實驗觀察到在AVM大血管的內膜區域存在SNAI1/2的過表達（圖1 B）。 SNAI1/2在對照腦血管系統中不表達。與對照組相比，nidal樣本中的SNAI1/2增加了約4倍（圖1 C）。鈣調蛋白1和轉凝蛋白在 cAVM 血管巢的內膜和中膜中均強烈表達。轉凝蛋白表達存在于對照組的小血管中，但鈣調蛋白1在對照血管系統中不表達。
N-鈣粘蛋白定位于病灶組織的新生內膜區域，在對照標本中未觀察到。也沒有在任何患者樣本的內層中觀察到N-鈣粘蛋白。與對照血管系統相比，發現整合素的活化形式α9/β1在cAVM病灶中下調。
圖1 腦動靜脈畸形中 EndMT 和主要細胞粘附標志物的失調。
腦動靜脈畸形表達更高水平的NICD3和NICD4
實驗最初研究了cAVM病灶中所有四個Notch受體基因Notch 1-4的表達，發現Notch3和Notch4 mRNA在病灶標本中顯著過表達。然后專門研究了激活的Notch受體的表達，即cAVM組織切片和對照腦樣本中的Notch細胞內結構域（NICD）。NICD3被發現高度表達并定位于血管巢的內膜和中膜，表明EndMT。cAVM中的NICD4受體水平較低，并且呈彌散模式，更靠近內膜，較少在中膜分布。蛋白質印跡分析進一步證實了AVM病灶中NICD3的表達升高。
振蕩流促進 γ-分泌酶依賴性 Notch 受體的激活
為了確定內皮細胞中是否發生振蕩剪切應力依賴性Notch受體活化，實驗使用流動室在暴露于規定流動條件下的hCMECs中進行基于qRT-PCR的mRNA分析和蛋白質免疫熒光測定，分析了暴露于平行剪切應力（15 dyn/cm2）24 h的hCMECs中的基因表達譜。結果發現，Notch1-4在平行單向流動條件下的mRNA表達與靜態流動條件下的表達沒有顯著差異（圖2 A）。與靜態相比，振蕩流（15 dyn/cm2）誘導內皮細胞中Notch3（4.11倍）和Notch4（2.06倍）mRNA的過表達。與暴露于平行流的細胞相比，振蕩流分別導致Notch3和Notch4增加了3.2倍和1.96倍。與靜態條件相比，平行流和振蕩流均未在hCMECs中誘導顯著的Notch1和Notch2表達（圖2 A）。
接下來，研究了暴露于各種流動條件的 hCMECs 中的 NICD 1、3 和 4 蛋白水平表達及其細胞定位。與平行流和靜態條件相比，暴露于振蕩剪切應力的內皮細胞中存在NICD3的過表達。振蕩剪切應力通過促進NICD3的核定位改變了Notch3受體的亞細胞定位。還發現細胞在24小時后以紡錘狀形態拉長。NICD4表達略有升高，但定位主要是細胞質。NICD1在三種流動條件下的細胞中均未顯著表達，但MFI分析表明暴露于振蕩流的細胞中略有過表達（圖2 B、C）。
此外，還研究了振蕩剪切應力是否通過誘導γ分泌酶活性直接誘導Notch受體激活，用0.5µM DAPT和250 nM RO4929097對暴露于振蕩流24 h 的hCMECs進行處理。兩種抑制劑都對hCMECs中γ-分泌酶誘導的Notch3受體的剪切應力反應產生了負面影響（圖2 D）。然而，RO4929097更具有統計學意義（圖2 E）。蛋白質印跡分析進一步證實了暴露于振蕩流的細胞中NICD3蛋白水平表達升高（圖2 F）。
圖2 通過人腦微血管內皮細胞（hCMEC/d3）中的振蕩液流激活Notch受體。
振蕩流誘導的 EndMT 需要 Notch 受體激活
hCMECs被用來研究振蕩剪切應力下內皮標志物的喪失和間充質特征的增強。mRNA表達分析顯示，與靜態相比，暴露于振蕩剪切應力的細胞中間充質CNN1和TAGLN上調。關鍵的EndMT標記物SNAI1和SNAI2的mRNA在振蕩流暴露細胞中也分別過表達3.59倍和3.83倍（圖3 A）。在暴露于振蕩流的細胞中，與SNAI1相比，Slug表達略高，證實了cAVM中的發現。
對暴露于靜態、平行和振蕩剪切應力的hCMECs中的SNAI1/2進行免疫熒光分析。與其他流動狀態相比，SNAI1/2 在振蕩流的細胞中過表達并定位于細胞核（圖3 B）。MFI分析表明，與靜態流和平行流相比，SNAI1/2表達分別增加了3.8倍和3.1倍（圖3 C）。
為了評估hCMECs中Notch通路在剪切應力誘導的EndMT中的參與，在振蕩流過程中使用了GSI DAPT（0.5μM）和RO4929097（250 nM），并監測EndMT因子的表達。在振蕩應力期間SNAI1/2在DAPT和RO4929097 下分別降低了約60%和80%，而抑制Notch受體切割消除了此影響（圖4 A、B）。這些數據表明，振蕩剪切應力誘導的EndMT需要Notch 信號。γ-分泌酶抑制劑RO4929097在改變流動條件下減少內皮細胞的間充質表型非常有效。
圖3 微血管內皮細胞中的振蕩流對 EndMT 和細胞粘附標志物的差異表達。
圖4 γ-分泌酶抑制劑（GSI）調節振蕩剪切誘導的EndMT和細胞侵襲性。
RO4929097促進細胞粘附并減少暴露于振蕩流細胞的侵襲性
為了證實cAVM組織中細胞粘附因子失調的發現，通過qRT-PCR研究了暴露于各種流動條件的內皮細胞中內皮VE-鈣粘蛋白，間充質N-鈣粘蛋白和整合素亞基α9和β1的基因的mRNA表達。在暴露于振蕩剪切應力的細胞中N-鈣粘蛋白和整合素α9上調，而VE-鈣粘蛋白和整合素β1下調（圖3 A）。
暴露于剪切應力條件的細胞中這些粘附因子的免疫熒光測定表明，與暴露于靜態和平行剪切應力的細胞相比，振蕩剪切應力下的細胞中N-鈣粘蛋白上調。在暴露于振蕩流24 h 的細胞中發現激活的整合素α9/ β1顯著降低（圖3 B、C）。
DAPT和RO4929097顯著降低了暴露于持續振蕩流的細胞中的N-鈣粘蛋白。有趣的是，在DAPT和RO4929097 存在下，整合素α9/ β1表達分別增加了45.5%和56.7%（圖4 A、B）。
細胞侵襲性增加是EndMT的一個重要結果。為了研究hCMECs在流動狀態下的侵襲特性，使用Matrigel跨膜侵襲測定。先前將細胞暴露于振蕩剪切應力24小時誘導內皮侵襲性增加，DAPT和RO4929097均基本阻斷了內皮細胞的侵襲性（圖4 C）。與DAPT相比，RO4929097有效防止細胞侵襲（圖4 D）。這一發現表明，靶向Notch信號通路的藥物干預可以有效降低血流誘導的血管內皮細胞侵襲能力和EndMT。
圖5 圖形概要
總之，該研究表明，在人類cAVM病灶中存在Notch受體和EndMT標志物。這是第一份報告，表明改變的血流誘導的Notch信號導致cAVMs中的EndMT，提供了Notch信號在內皮細胞暴露于干擾流中增強細胞侵襲性的直接作用的證據。
參考文獻：Karthika CL, Venugopal V, Sreelakshmi BJ, Krithika S, Thomas JM, Abraham M, Kartha CC, Rajavelu A, Sumi S. Oscillatory shear stress modulates Notch-mediated endothelial mesenchymal plasticity in cerebral arteriovenous malformations. Cell Mol Biol Lett. 2023 Mar 18;28(1):22. doi: 10.1186/s11658-023-00436-x. PMID: 36934253; PMCID: PMC10024393.
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。
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