【期刊】：Nature genetics
【影響因子】：41.307
2022年12月，美國麻省理工大學Ilon Liu和Mariella G. Filbin教授通過單細胞測序建立不同年齡組H3-K27M突變驅動的彌漫性中線膠質瘤(DMG)患者中線位置圖譜，描述了年齡和空間位置如何根據共同的驅動基因突變塑造膠質瘤細胞的內在和外在特征。

01用單細胞技術解決了什么問題？
作者利用單細胞多組學和空間轉錄組學方法分析H3-K27M DMG的擴展隊列，確定了年齡和解剖位置如何根據共同的驅動基因突變塑造膠質瘤細胞的內在和外在特征，這些特征共同決定了常見的K27M突變以及膠質瘤空間和細胞結構的變化。
02實驗亮點
通過單細胞測序配合其它研究手段解釋了與年齡相關的微環境因素如何差異地塑造腫瘤細胞狀態。
03臨床意義
作者提供了跨空間和時間的H3-K27M DMG細胞異質性的廣泛資源，有助于描繪特定時空環境下的細胞特性和微環境生態位之間的多方面相互作用，以設計合理的建模研究和治療框架。

研究背景
由組蛋白3賴氨酸27至蛋氨酸(H3-K27M)突變驅動的彌漫性中線膠質瘤(DMG)是最致命的腦腫瘤之一，發病率在年幼兒童腦干腦橋區域達到峰值。有研究表明腦橋中的前體細胞和早期神經發育窗口作為K27M突變介導的膠質瘤發生的時空相關性。從細胞內在上講，K27M突變導致廣泛的表觀遺傳失調，從而將發育受限的細胞轉變為致瘤性干細胞狀態。然而，對于不同中線位置(如丘腦、腦橋或脊髓)以及不同年齡組和呈現出不同形態特征的H3-K27M DMG是否具有相似的細胞組成還不完全清楚。年齡和區域特異性組織環境與H3-K27M DMG的不同臨床解剖學特征之間的相互作用及其對腫瘤病理學的貢獻仍未得到探索。因此，本研究利用單細胞多組學和空間轉錄組學方法來分析，進一步解析了H3-K27M DMG細胞群的空間組織，并鑒定了有絲分裂的少突膠質細胞譜系生態位。 研究結果
1、跨時空的H3-K27M DMG細胞圖譜構建
作者對50個H3-K27M突變患者腫瘤進行了多組學分析，取腦橋、丘腦、下腦干和脊柱進行scRNA-seq/snRNA-seq(圖1a,b)。作者通過CNA分析以及UMAP圖展示了H3-K27M DMG細胞組成和按年齡和位置分層的細胞亞群的轉錄異質性(圖1c-d)。
2、不同時空背景下的H3-K27M DMG細胞組成
通過對腫瘤細胞進一步細分得到OPC-like、AC-like、OC-like、Cycling、MES-like(圖2a)。其中OPC-like細胞普遍存在于所有腫瘤中，與年齡或位置無關，而MES-like則首次在H3-K27M DMG被檢測到(圖2a-d)。相同位置和年齡組但不同基因型的原發性膠質瘤的比較支持K27M突變的直接細胞內在效應，使腫瘤細胞偏向膠質/OPC-like而非neuron-like。
利用SCENIC發現了在正常神經膠質細胞中已知的關鍵基因調控網絡(GRN)在H3-K27M DMG腫瘤細胞對應物中同樣具有活性，突出了正常發育的神經膠質和腫瘤細胞的相似性(圖2e)。通過比較腫瘤位置和年齡組的細胞組成發現，MES-like在成人腫瘤中顯著富集，又通過RNA原位雜交進行驗證(圖2f，2h)，并觀察到MES-like特征與年齡的關聯(圖2i)，這表明非編碼突變和/或非遺傳決定因素可能是觀察到的年齡特異性的基礎。因此，H3-K27M DMG偏向于獨立于年齡或中線位置的OPC-like細胞身份，這表明K27M癌組蛋白突變本身的細胞內在效應。
3、OPC-like亞群的位置特異性
通過對OPC-like無監督聚類得到3亞群，OPC-like-1表達經典OPC的marker基因，相比之下，OPC-like-2和OPC-like-3細胞表現出前OPC分化狀態(圖3a-f)。使用scRNA-seq數據集對OPC-like亞群特異性GRN的分析發現，SHOX2和OTX2等TF在OPC-like-1細胞中具有最特異性的活性(圖3g)。OPC-like-2細胞特有的GRN包括Notch信號調節因子HES6以及HOX家族的多個圖案化TF，OPC-like-3細胞的GRN特征與AP-1 TF家族相關(圖3g)。比較OPC-like亞群在時空分層的來源，腦橋中前OPC-like細胞顯著富集，OPC-like-1細胞富集在丘腦腫瘤中(圖3h)。
4、H3-K27M DMG細胞群的開放染色質景觀
作者通過8個腫瘤的snATAC-seq來探測單核可及染色質譜，以補充和驗證單細胞轉錄組。結果證明snATAC-seq與scRNA-seq衍生的細胞群基本一致，包括AC-like細胞(圖4a,b)。通過將snATAC-seq衍生的可訪問染色質區域/峰與scRNA-seq相關聯，測量其最接近相關基因的表達水平，確定了順式調節DNA元件(CRE)及其靶基因的13632個潛在的峰-基因鏈接(圖4c)。其中，287個基因表現出超過8個(前5%)相關的CRE，表示高調控位點復雜性，是關鍵譜系標記基因的決定因素(圖4d，e)。OPC/OC-like細胞特異性預測染色質(GPCs)相關的基因，表明對普遍存在的H3-K27M DMG的少突膠質譜系進行高度合作的調節(圖4e)，將候選GPC與H3-K27ac ChIP-seq衍生的H3-K27M原發性腫瘤的超級增強子譜疊加,證明了GPC與H3-K27M DMG超級增強子調節基因的顯著重疊(圖4f)。進一步發現含有SOX8 TF結合位點的16個CRE相連，進一步預測其在OPC-like細胞中具有差異活性(圖4g,h)。所有腫瘤細胞狀態的GPC的CRE中基因表達，染色質可及性和細胞狀態特異性TF富集之間的相互依賴性，例如AC樣標記基因ITPKB(圖4i)。這些證實了染色質調控和基因表達在多個層面上的緊密交織和細胞狀態特異性。
5、H3-K27M DMG中的年齡特異性骨髓細胞景觀
本研究通過基因集打分將TAM分為小膠質細胞和巨噬細胞(圖5a–c)，不同年齡組的小膠質細胞與巨噬細胞比例的比較顯示，兒童DMG中的小膠質細胞發生率較高，而成人DMG中巨噬細胞的發生率較高(圖5d)，腫瘤位置似乎不影響這些比例。在本研究的隊列中，與兒童H3-K27M DMG相比，成人MES-like細胞的顯著富集，并在成人TAM中檢測到更高的OSM表達及相應的受體OSMR(圖5e，f)，表明免疫介導途徑的參與誘導成人腫瘤中的MES-like表型。此外，與兒童TAM相比，觀察到成人MES-like標記基因在間充質富集的膠質瘤中表達增加(圖5g)。通過分析正常小鼠腦骨髓細胞圖譜中跨年齡的基因表達，觀察到配體OSM和間充質標志基因隨著年齡的增長而增加(圖5h)，表明H3-K27M DMG腫瘤MES-like狀態隨年齡的增長與腦髓區室的變化有關，這種變化在正常發育和衰老過程中也發生。
6、繪制H3-K27M DMG的單細胞空間結構圖
在16個患者H3-K27M DMG組織切片中使用一組從 scRNA-seq 數據集中收集的 116個細胞類型特異性組合標記基因(圖6a-c)。通過原位測序(pciSeq)的概率細胞分型分析了空間細胞狀態組成，觀察到AC-like細胞構成了主要的惡性細胞區室(圖6c)。相對于兒童腫瘤，成人H3-K27M DMG切片具有更高比例的MES-like腫瘤細胞(圖6d)。惡性細胞鄰域的全局分析表明，OPC-like/Cycling 和 OC-like細胞的共定位更高(圖6e)，通過多重免疫熒光(IF)成像驗證增殖OPC-like和OC-like細胞的首選為有絲分裂生態位，被更分化的，不增殖的AC-like細胞包圍(圖6f)。通過計算聚類系數發現AC-like細胞，非惡性星形膠質細胞和TAMs與其他細胞類型/狀態聚集的最高趨勢，暗示它們更彌漫分布，而不是局限于有限的空間區室(圖6g)。因此，在天然腫瘤組織內解析了scRNA-seq定義的H3-K27M DMG細胞群的空間結構，特別是表明存在有絲分裂干樣生態位，其中少突膠質細胞譜系的H3-K27M腫瘤細胞(OPC-like和OC-like癌細胞)共定位。
本研究提供了跨空間和時間的H3-K27M DMG細胞異質性的廣泛資源，有助于描繪時空環境特定細胞特性和微環境生態位之間的多方面相互作用，以設計合理的建模研究和治療框架，為這種致命膠質瘤的不同臨床解剖學群體量身定制。

參考文獻
Liu, I., Jiang, L., Samuelsson, E.R. et al. The landscape of tumor cell states and spatial organization in H3-K27M mutant diffuse midline glioma across age and location. Nat Genet (2022).
https://doi.org/10.1038/s41588-022-01236-3.