海洋生物細胞由于其復雜性，在單細胞測序?qū)嶒炛谐晒β释�往較低。而BD Rhapsody憑借其特點和優(yōu)勢，讓海洋生物單細胞測序研究不再有后顧之憂：

1.BD Rhapsody最大程度降低外界對實驗的干擾

基于微孔板原理，細胞自然沉降，不會對細胞產(chǎn)生任何壓力刺激，在細胞裂解后，磁珠捕獲mRNA，之后被磁鐵回收，所有外界干擾因素如化學試劑、金屬離子、酶等都會被清洗，在干凈的反應體系中進行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實驗，最大程度降低細胞剪切力、溫度、化學試劑對細胞的刺激和影響，不會改變轉(zhuǎn)錄本表達特征，真實還原實驗設計預期條件。

2. BD Rhapsody  Scanner質(zhì)控系統(tǒng)，過程監(jiān)控，確保質(zhì)量

尤其是有些海洋生物細胞偏小、mRNA含量偏低，在細胞捕獲過程中，會造成一定的細胞數(shù)目偏差。BD Scanner可視化質(zhì)控系統(tǒng)，能實時監(jiān)控單細胞實驗情況并輸出包含細胞濃度、細胞計數(shù)、細胞活性、雙細胞率、細胞回收率、磁珠回收率等數(shù)據(jù)報告，從而可以及時調(diào)整實驗參數(shù)，有效保證實驗質(zhì)量。

那么如何利用BD Rhapsody進行海洋生物單細胞實驗呢？下面就跟“小海膽”一起看一篇文獻實例吧~

研究背景

合子基因組激活是胚胎早期發(fā)育過程中一個普遍的過程，涉及到合子細胞核的重編程，并啟動整體轉(zhuǎn)錄。近些年來，研究者使用不同的生物模型來探究這個過程，并且提出了不同的合子基因組激活機制的模型，包括核質(zhì)比模型，激活因子積累模型，染色質(zhì)動態(tài)變化模型。然而合子基因組激活卻仍未有一個共性的認知，尤其是對管家基因再激活過程。海鞘作為脊椎動物的近親之一，已被用于胚胎研究多年，多種不同海鞘的細胞譜系已得到表征，并且也有基因組測序數(shù)據(jù)。

2022年6月1日，中國海洋大學董波研究團隊和昆明理工大學陳凱團隊，在bioRxiv上發(fā)表了題為“Spatiotemporal dynamics of zygotic genome activation in basal chordates revealed by interspecific hybrids”的研究論文。該研究論文利用兩種不同的海鞘物種進行雜交，通過同源基因的多樣性區(qū)分不同來源的基因，發(fā)現(xiàn)了在8細胞到110細胞階段會有兩波分別代表早期胚胎發(fā)育和管家基因再激活的合子基因組激活過程。比較分析揭示了母本與合子基因間的調(diào)控以及等位特異性表達的調(diào)控是以物種的方式而不是親本相關的方式。作者利用BD Rhapsody單細胞平臺解析了早期神經(jīng)元階段海鞘胚胎單細胞轉(zhuǎn)錄組譜式，揭示了父源管家基因的時空差異性激活與每種細胞類型的力學性質(zhì)顯著相關。這為人們了解基底脊索動物的進化和適應提供了新的研究系統(tǒng)。

實驗結果：

兩種不同海鞘物種的雜交及轉(zhuǎn)錄組測序

Ciona robusta 和 C. savignyi 是兩種形態(tài)相似但已經(jīng)分開進化122百萬年的被囊動物。這兩種海鞘高度分化且具有互育性，因此可以作為研究雜交胚胎的優(yōu)秀模型。作者首先評估了雜交胚胎的發(fā)育能力，結果發(fā)現(xiàn)在尾芽期胚胎之前，不同雜交的胚胎發(fā)育時相和形態(tài)是類似的。盡管這兩種海鞘形態(tài)相似，但在基因組上有很大差異，因此可以用于區(qū)分等位基因的親本來源。為了解析合子轉(zhuǎn)錄本的激活，作者收集了1,2,4,8,16,32,64,100細胞時期胚胎和中期囊胚，早期神經(jīng)元進行bulk RNA測序，64細胞，110細胞和早期神經(jīng)元階段進行單細胞測序。

胚胎早期發(fā)育過程中兩波協(xié)調(diào)的合子激活

作者將 C. robusta 和 C. savignyi 的雜交胚胎的RNA數(shù)據(jù)比對回基因組發(fā)現(xiàn)，不管是Cs ♂ × Cr♀ 或 Cr ♂ × Cs♀的胚胎，在4細胞之前，>99.99%的數(shù)據(jù)都比對到了母本。父本轉(zhuǎn)錄組從8細胞時期開始檢測到，從16到32細胞階段比例開始顯著增加。另一個階段是從64細胞到110細胞階段，父本轉(zhuǎn)錄組比例開始增加。這種父母本基因組不同比例轉(zhuǎn)錄本的情況在神經(jīng)元早期和晚期開始消失。

作者接下來分析了基因表達水平的FPKM值，結果發(fā)現(xiàn)合子基因的首次表達出現(xiàn)在8細胞階段，在從16到32細胞階段以及從64到110細胞階段開始增加。父源基因的WGCNA分析發(fā)現(xiàn)，Cs♂ × Cr♀子代胚胎的基因可以分為5類，1類基因在16到32細胞階段上調(diào)，2到3類基因在64到100細胞階段上調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)1類基因主要與調(diào)控相關，可能在第2波合子激活過程中起到調(diào)節(jié)作用。

Figure1. 海鞘胚胎發(fā)育過程中兩波協(xié)調(diào)的合子激活

雜交模型胚胎發(fā)育過程中等位基因的激活

接下來作者比較了母本中兩波合子激活的調(diào)控關系。兩個物種中整體調(diào)控的模式可能是相似的。作者首先鑒定了調(diào)控基序注釋好的轉(zhuǎn)錄因子，接下來就開始查看這些轉(zhuǎn)錄因子與對應基因之間的調(diào)控關系。基序分析發(fā)現(xiàn)第一波合子激活中調(diào)控基因多與母本轉(zhuǎn)錄因子相關，而第二波合子激活中則與合子表達基因相關。通過比較兩種物種的發(fā)育相關基因發(fā)現(xiàn)，合子激活中兩個物種間轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控基因的關系是相似的。

作者進一步分析了等位基因特異性表達的情況，在檢測到的5,879個同源基因中，有341個基因是合子特異性表達的。從8細胞到32細胞階段的早期表達基因主要都是母本主導基因，而在64到110細胞胚胎的過渡階段，開始檢測到更多的父源基因。從110細胞胚胎到晚期神經(jīng)元階段，分別有138和106個基因是Cr和Cs主導的。

Figure2. 雜交模型胚胎發(fā)育過程中等位基因的激活

單細胞測序揭示管家基因的激活

Ciona的不對稱分裂從16細胞階段起始，時間點要比管家基因的再激活要早。同時Ciona胚胎的不變譜系的嵌合發(fā)育為研究合子激活提供了獨特的優(yōu)勢。作者利用BD Rhapsody單細胞平臺檢測了早期神經(jīng)元胚胎階段的單細胞轉(zhuǎn)錄組。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)64細胞，110細胞和早期神經(jīng)元階段細胞分別可以被分成9,12,19個細胞群，而這些細胞群可以進一步被注釋成內(nèi)胚層、脊索、間充質(zhì)、肌肉、神經(jīng)索、神經(jīng)和表皮等。作者比較了每個細胞群的合子激活。在64細胞階段，內(nèi)胚層細胞中有最高比例的父本轉(zhuǎn)錄組激活。在神經(jīng)元早期，神經(jīng)索和間充質(zhì)B細胞的父系轉(zhuǎn)錄本增加，各類細胞群的父系轉(zhuǎn)錄本比例的差異開始縮小。不同譜系中父系管家基因的重新激活存在差異，這表明管家基因的重新激活并不遵循發(fā)育時鐘模型。此外，作者還用這些數(shù)據(jù)檢測了其他合子激活模型的可靠性。發(fā)現(xiàn)細胞分裂時間與合子基因激活時間不相關，細胞體積也與Ciona合子激活不相關。

Figure3. 單細胞測序揭示管家基因的激活

總結與展望

這項研究工作利用兩種高度分化的海鞘進行雜交，通過同源基因的多樣性來區(qū)分不同基因來源。通過對不同時期雜交胚胎的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，雜交胚胎的合子激活主要有兩個階段，第一波主要從16到32細胞階，而第二波則從64細胞到110細胞階段，父本轉(zhuǎn)錄組比例開始增加，并且兩波合子基因組激活是有協(xié)調(diào)作用的。最終，論文通過雜交胚胎解析了合子基因組激活的過程和調(diào)控機制，并且為研究人員了解基底脊索動物的進化和適應提供了新的研究系統(tǒng)。在這項研究中，BD Rhapsody單細胞平臺發(fā)揮了重要作用，揭示了早期神經(jīng)元胚胎階段的單細胞圖譜和早期神經(jīng)元階段細胞的等位特異性表達，為解析胚胎合子激活的過程提供了數(shù)據(jù)。

單細胞多組學平臺
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 單細胞多組學分析系統(tǒng)能夠?qū)Τ汕�上萬個單細胞的蛋白與基因進行數(shù)字定量，提供靈活的定制化Panel及標準化應用方案，以滿足不同的實驗需求，其獨特的混樣技術可有效節(jié)約時間與成本。