哈嘍，艾瑞巴蒂！今天碎碎帶來了活體轉染第六彈，給大家淺談一下活體轉染試劑在癌癥啟動子特異性選擇中的應用。

本次選取的這篇文章發表在Cancers，題為-Conversion of a Non-Cancer-Selective Promoter into a Cancer-Selective Promoter。 

此項研究發現一種特異性調節癌細胞中轉基因表達的遺傳工具，可以通過在大鼠pGADD(GADD34最小啟動子)中引入特定的點突變將這種非癌癥特異性啟動子轉化為癌癥選擇性啟動子, 并且添加GATA2和現有的AP1和PEA3轉錄因子將進一步增強了GAPE-Prom的癌癥選擇性活性。GAPE-Prom提供了一種特異性調節癌細胞中轉基因表達的遺傳工具。

背景:
PEG3是一種廣譜的腫瘤特異性基因,在人癌細胞系中明顯高表達,而在正常組織細胞中極少表達，它的啟動子表現出癌癥選擇性表達，允許轉基因的癌癥定向調節，病毒復制和動物腫瘤和轉移的體內成像。而GADD34的過表達抑制生長并誘導細胞凋亡，它的啟動子缺少癌癥特異性。但是PEG-3和GADD34的最小啟動子具有強烈的序列同源性，除了兩個單點突變。本文探索了改變這兩種核苷酸在決定癌癥選擇性基因表達中的相關性。

接著我們具體看看文章中活體轉染的應用思路吧

首先為了確定為什么pPEG（PEG34最小啟動子）與pGADD的功能差異，比較了二者序列，發現兩個不同的堿基對，后對pGADD進行定點突變，轉化為pPEG，稱pGAPE。后將啟動子克隆到載體上后轉化進人的癌細胞，原代細胞，以及正常的永生細胞中，進行熒光素酶檢測。
結果表明pGAPE與pPEG在癌細胞中表現出類似的高表達。而在上的所有細胞系中， pGADD活性沒有顯著變化(Fig 1)。

Fig.1 在癌細胞中pGAPE展現出與pPEG類似的高表達

接著，作者驗證了腫瘤動物體內pPEG和pGAPE啟動子的癌癥特異性。使用in vivo jetPEI 進進行不同啟動子的傳遞和成像。在這里，作者選取雄性無胸腺裸鼠，進行全身給藥。40 μg DNA 和 4.8 μL in vivo jetPEI 分別稀釋在不含內毒素的 5% (wt/vol) 葡萄糖中，混合，配置成400ul注射液。單次 200 μL 注射液以 5分鐘的間隔靜脈注射兩次。注射后48h進行活體成像觀察。這里，作者特意選取in vivo jetPEI而非病毒遞送，來避免有偏好的全身遞送。


結果表明，在所有的模型中，當由pPEG或pGAPE驅動時，可以通過BLI特異性地在腫瘤中檢測到熒光素酶，而由pGADD驅動的熒光素酶活性對腫瘤不具有特異性。

最后，作者總結兩點突變對于將非癌癥特異性pGADD轉化為癌癥選擇性pGAPE至關重要，這種新設計的pGAPE體現了所有必要的功能，使其成為以癌癥選擇性方式調節轉基因表達的理想工具，既可以無創地提供成像劑以跟蹤腫瘤促進和轉移，又可以創建表達癌癥中獨特復制功能的CRAD。