發表期刊：Cell Metabolism
影響因子：22.415
發表時間：2019年5月30日
合作單位：中國科學技術大學

Biotree協助客戶中國科學技術大學吳緬教授和安徽醫科大學胡汪來教授及其研究團隊在國際頂尖期刊《Cell Metabolism》上發表名為“CircACC1 Regulates Assembly and Activation of AMPK Complex under Metabolic Stress ”的研究成果。CircRNA+代謝組，如何研究才能發表在IF=22.415的頂級期刊上？下面小趣和大家一起學習下這篇文章的精彩之處。

研究背景

AMPK（AMP活化蛋白激酶）是維持能量平衡的重要代謝酶之一，是細胞能量狀態關鍵感受器，平衡細胞的合成和分解，在控制脂肪酸氧化、糖酵解和脂解作用中起重要作用。百趣代謝組學文獻分享，AMPK已在2型糖尿病和代謝綜合征中得到廣泛研究，被視為癌癥治療重要的潛在靶點。目前對于非編碼RNA調控AMPK的研究有限，已有報道LncRNA參與調控AMPK，但CircRNA是否參與AMPK調控卻尚未研究。

研究結果

1. CircACC1的發現和鑒定

作者試圖找到與脂質代謝相關的circRNA，首先找出與脂質代謝有關的91個基因，結合前人研究過的1444個circRNAs，篩選出了6個候選基因，7個circRNAs。然后作者在HCT細胞中用RNA酶消化后，RT-PCR檢測7種circRNAs的表達水平，7種circRNAs都有表達。百趣代謝組學文獻分享，用siRNA抑制每個circRNA的表達，發現只有抑制circACC1時會導致脂質積累，證明了circACC1與脂質代謝相關。

circACC1是來源于人類17號染色體的ACC1基因，與小鼠序列沒有同源性，后面Northern雜交的試驗也驗證了是環狀的RNA。用RNase R處理對Total RNA進行qPCR分析，結果表明circACC1和CDR1未被降解，而β-actin和ACC1 mRNA被降解。百趣代謝組學文獻分享，Actinomycin D處理結果也表明circACC1比ACC1 mRNA更穩定。這些都證明circACC1確實是環狀的RNA。
 

圖1. CircACC1的鑒定及參與脂質代謝

2.CircACC1促進糖酵解和脂肪酸氧化
為了進一步研究circACC1的功能，作者在LO2（人正常肝細胞系）細胞中敲低circACC1發現脂質含量升高。相反，在HCT116和LO2中過表達circACC1則脂質含量降低。circACC1的敲除或超表達對ACC1 mRNA和ACC1蛋白水平沒有影響。百趣代謝組學文獻分享，對circACC1沉默后細胞中的脂質成分進行代謝組分析，包括用LC-MS分析脂質代謝及GC-MS檢測游離脂肪酸，結果發現脂質及游離脂肪酸含量顯著增高。

AMPK是維持能量平衡的重要樞紐，在能量應激中，AMPK通過磷酸化PFK-2從而促進糖酵解， 通過磷酸化ACC1抑制脂肪酸合成。敲低circACC1抑制了ACC1和PFKFB3的磷酸化，過表達circACC1促進PFKFB3的磷酸化。沉默circACC1后細胞中ATP、NADPH和胞外乳酸含量均增加，同時增加了ROS水平，而超表達circACC1后結果完全相反。這些數據表明circACC1可以增強AMPK的活性，從而促進糖酵解和脂肪酸的氧化。
 

圖2. CircACC1促進糖酵解和脂肪酸氧化
 

3.CircACC1直接與AMPK的 β 和 γ 亞基結合

上述結果表明circACC1可以調控AMPK，那么它們是如何相互作用的呢？作者進行了進一步研究。FISH試驗表明AMPK和circACC1都存在于細胞質中。Pull-down試驗表明AMPK的每一個亞單位都可以用反義探針選擇性地捕獲。百趣代謝組學文獻分享，RNA免疫沉淀（RIP）分析表明，circACC1與AMPK β1和γ1亞單位有很強的相互作用，但與ɑ1的結合很小。

在此基礎上，作者進一步研究circACC1與AMPK β1和γ1的相互作用是否與全酶有關。百趣代謝組學文獻分享，兩步免疫共沉淀均可檢測到circACC1和AMPK3個亞基。體外EMSA實驗表明只有AMPK β1和γ1能與circACC1進行共沉淀，而ɑ1不能。將P1段拆分為P1和P2兩段，最終研究發現P1段是circACC1與AMPK β 和 γ 結合位點。
 

圖3. CircACC1與AMPK的 β 和 γ 亞基直接結合
 

4.CircACC1提高AMPK全酶的穩定性和活性

上面的試驗發現敲低circACC1導致AMPK三個亞基水平均降低，蛋白酶體抑制劑能恢復因敲低circACC1導致的AMPK水平下調，表明circACC1影響AMPK蛋白質穩定性。百趣代謝組學文獻分享，circACC1敲低顯著降低了AMPK的半衰期，增加AMPK亞基多聚泛素化水平。單獨敲除AMPK的三個亞基會導致其他亞基水平大大降低。用MG132穩定蛋白水平后，敲除circACC1后AMPK亞基間結合能力下降，表明circACC1可以提高AMPK全酶的穩定性。作者同時用哺乳動物雙雜交試驗進行進一步驗證，結果表明circACC1沉默使AMPK β1和γ1結合作用降低，超表達circACC1使AMPK β1和γ1結合能力增強。
 

圖4. CircACC1提高AMPK全酶的穩定性和活性

5. CircACC1直接調控AMPK的活性

AMPK在維持能量平衡中起著非常重要的調控作用，可以感知和響應細胞能量和營養狀態的變化。那么不同的應激條件是如何影響circACC1的表達呢？RT-PCR結果分析表明，血清饑餓狀態能刺激circACC1的表達以及pre-ACC1的生成，但是對成熟circACC1 mRNA的表達水平并無影響。隨后補充血清發現circACC1的水平也隨之降低，說明circACC1 受到血清水平有效的調節。

百趣代謝組學文獻分享，AMPK的活性受幾種激酶的調控，包括LKB1，CaMKK2和TAK1。那么circACC1是否是通過這些激酶調節AMPK的活性呢？作者對此也進行了研究，敲除LKB1、CaMKK2和TAK1確實能夠降低AMPK和PFKFB3的活性，并降低了ACC1磷酸化。然后分別干涉LKB1、CaMKK2和TAK1，超表達circACC1，發現AMPK活性增強，而不受三種激酶表達的影響。說明circACC1可以直接調節AMPK的活性，而不是通過激酶調節。
 

圖5. CircACC1調控AMPK的活性

6.在血清饑餓狀態下C-Jun促進CircACC1的表達

對ACC1的啟動子進行分析，有CEBPA、c-Jun、CREB1和SREBF1結合位點，為了確定這些轉錄因子是否參與circACC1的調控，作者分別對這些轉錄因子進行敲除研究，發現只有c-Jun的沉默會顯著降低circACC1的表達，表明c-Jun參與了circACC1的調控。百趣代謝組學文獻分享，隨后作者用CHIP試驗和熒光素酶報告驗證了c-Jun與ACC1啟動子的結合。血清饑餓后誘導c-Jun激活，JNK和 AMPK信號增強，ACC1的水平降低。干涉c-Jun后AMPK和PFK2活性降低，超表達 circACC1后其活性恢復，這些研究表明c-Jun可促進circACC1的表達，增強AMPK活性。
 

圖6. 在血清饑餓狀態下C-Jun促進CircACC1的表達
 

7.CircACC1的發現在腫瘤治療中的意義

那么circACC1的發現在腫瘤治療中有什么意義呢？在HCT116細胞中沉默circACC1抑制了細胞的增殖，超表達circACC1促進細胞生長。作者同時也測定了結腸癌組織及鄰近非癌組織中circACC1表達情況，發現腫瘤組織circACC1的表達水平顯著高于正常組織，多數癌癥組織中c-Jun和AMPK水平也高于正常組織。百趣代謝組學文獻分享，circACC1的表達與c-Jun和AMPK的活性呈正相關。
 

圖7. CircACC1在腫瘤發生中的意義
 

總結

本研究首先篩選和鑒定與脂質代謝相關的circRNA—circACC1，代謝組方面包括用LC-MS檢測脂質代謝組及用GC-MS檢測游離脂肪酸。然后通過基因敲除試驗證實circACC1調控AMPK，進一步分析circACC1與AMPK相互作用的機理，即circACC1直接與AMPK的 β 和 γ 亞基結合。百趣代謝組學文獻分享，基因敲除試驗和哺乳動物雙雜交試驗發現circACC1提高AMPK全酶的穩定性和活性。作者還對ACC1的啟動子進行分析，發現c-Jun與ACC1啟動子結合，c-Jun可促進circACC1的表達。最后探索在腫瘤發生中的意義，發現沉默circACC1能抑制了細胞的增殖，結腸癌組織中circACC1的水平也顯著高于正常組織。百趣代謝組學文獻分享，本文研究思路嚴謹縝密，試驗設計環環相扣，層層遞進，每步都有充足的試驗驗證，工作量之大讓人嘆服，值得學習。

本次研究，BIOTREE協助老師們進行了經典脂質組學及游離脂肪酸高通量靶標定量檢測，文章的最后，老師們也對BIOTREE進行了致謝，謝謝老師們的認可，客戶的認同是BIOTREE前行最大的動力！