冠心病(CHD，coronary heart disease)目前仍然是導(dǎo)致全球女性和男性死亡的主要原因。然而冠心病在不同性別中的臨床表現(xiàn)不同，女性表現(xiàn)出更高比例的非阻塞性動(dòng)脈粥樣硬化和微血管疾病以及死亡率[1]。

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，糖尿病是女性冠心病患者的高風(fēng)險(xiǎn)因子，2型糖尿病女性比男性有大于40%概率的高風(fēng)險(xiǎn)易患冠心病[2,3]。此外，現(xiàn)在已有報(bào)道TCA循環(huán)代謝物、腸道菌群代謝物TMAO、脂類代謝物與冠心病事件發(fā)生密切相關(guān)，glutamate和glutamine以及芳香族氨基酸與糖尿病和冠心病密切相關(guān)[4-13]。

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，但是，盡管已有證據(jù)表明性別會(huì)影響人體代謝物輪廓譜[14,15]，而國際上使用代謝組學(xué)研究代謝物與女性患冠心病風(fēng)險(xiǎn)，尤其是女性絕經(jīng)與冠心病之間的相關(guān)研究更是稀缺[16]。

因此，本研究先采用LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)去挖掘WHI (Women’s Health Initiative) [17]和 WHI-OS (Women’s Health Initiative-Observational Study) [18]人群隊(duì)列中絕經(jīng)女性冠心病事件與代謝物間的關(guān)系，然后在WHI-HT (Women’s Health Initiative-Hormone Trials)[19]人群隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證，最后在另一個(gè)獨(dú)立的PREDIMED飲食干預(yù) (Prevención con Dieta Mediterránea) [20,21]人群隊(duì)列中評(píng)估了這些顯著性關(guān)聯(lián)物質(zhì)在男女性別中的普適性。

本研究[22]從WHI-OS人群隊(duì)列（含>93676位絕經(jīng)女性）中挑選出472對(duì)絕經(jīng)女性冠心病患者和健康對(duì)照絕經(jīng)女性，匹配了種族、民族、子宮切除手術(shù)、年齡（±5年）、以及納入隊(duì)列時(shí)間（±2年）等因素；

從WHI-HT人群隊(duì)列（含>16608位絕經(jīng)女性，>10739位子宮切除女性）中挑選出312位絕經(jīng)女性冠心病和315位健康對(duì)照女性，匹配了種族、民族、子宮切除手術(shù)、年齡（±5年）以及納入隊(duì)列時(shí)間（±2年）等因素（如 table1 所示），從PREDIMED人群隊(duì)列（含1017位男性和女性地中海飲食干預(yù)冠心病）選出980位參與者（230位有心血管疾病事件）的血漿樣本進(jìn)行代謝組學(xué)檢測(cè)，

在該研究中使用4種互補(bǔ)的LC-MS檢測(cè)方法（HILIC-positive（Q Exactive hybrid quadrupole orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific)）、HILIC-negative（5500 QTRAP mass spectrometer [SCIEX])）、C8-positive（Exactive Plus orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific)）、C18-negative（Q Exactive hybrid quadrupole orbitrap mass spec- trometer (Thermo Fisher Scientific)）在WHI(-OS/-HT)人群樣本中檢測(cè)到了371個(gè)代謝物，其中PREDIMED只使用HILIC-positive、C8-positive兩種方法檢測(cè)。
 

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，在WHI-OS人群隊(duì)列中，通過使用邏輯回歸模型發(fā)現(xiàn)檢測(cè)出的371個(gè)代謝物中有60個(gè)物質(zhì)與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)（以樣本篩選匹配的變量為協(xié)變量，校正后P<0.05），加上CHD臨床風(fēng)險(xiǎn)因子作為協(xié)變量發(fā)現(xiàn)36個(gè)物質(zhì)與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)，17個(gè)物質(zhì)不受CHD臨床風(fēng)險(xiǎn)因子影響。

在WHI-HT人群隊(duì)列中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，以樣本篩選匹配的變量為協(xié)變量有33個(gè)物質(zhì)與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)（校正后P<0.05），加上CHD臨床風(fēng)險(xiǎn)因子為協(xié)變量有8個(gè)物質(zhì)與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)，其中7個(gè)物質(zhì)具有增加冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)：C34:2 hydroxy-PC, C36:4 hydroxy-PC, 5-hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), 15-HETE, 11-HETE, glutamate, cytidine monophosphate，1個(gè)物質(zhì)具有降低冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)：glutamine（如 table2 所示）。
 

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，將8個(gè)在2個(gè)獨(dú)立人群隊(duì)列中經(jīng)過驗(yàn)證的代謝物在邏輯回歸模型中進(jìn)行相互校正，發(fā)現(xiàn)只有C34:2 hydroxy-PC在WHI人群中仍然與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)，該物質(zhì)含量最高四分位絕經(jīng)女性人群比最低四分位絕經(jīng)女性人群有4.69倍 (95% confidence interval, 2.84– 7.90) 的風(fēng)險(xiǎn)患冠心病。

如圖1所示根據(jù)C34:2 hydroxy-PC含量進(jìn)行WHI-HT人群隊(duì)列亞組分型，該物質(zhì)與冠心病臨床風(fēng)險(xiǎn)因子關(guān)系仍然顯著相關(guān)。典型CHD風(fēng)險(xiǎn)因子（ROC曲線下面積AUC=0.76）與C34:2 hydroxy-PC結(jié)合（AUC=0.79）進(jìn)行冠心病預(yù)測(cè)顯著性提高了AUC（95% confidence interval, 0.01–0.05; P<0.01）。
 

圖1. WHI-HT隊(duì)列中C34:2 hydroxy-PC含量亞組分型分析。BMI indicates body mass index; CI, confidence interval; CRP, C-reactive protein; HDL, high-density lipopro- tein; hydroxy-PC, hydroxy-phospha- tidylcholine; OR, odds ratio; and WHI-HT, Women’s Health Initiative- Hormone Trials.

為了驗(yàn)證WHI人群隊(duì)列發(fā)現(xiàn)的代謝物與冠心病事件的關(guān)聯(lián)是否具有普適性，使用2種LC-MS檢測(cè)方法在PREDIMED人群隊(duì)列中驗(yàn)證了4個(gè)物質(zhì)（glutamine, glutamate, C34:2 hydroxy-PC, and C36:4 hydroxy-PC）與冠心病事件發(fā)生的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)：1）除了glutamine物質(zhì)，其他3個(gè)物質(zhì)在男女混合冠心病事件發(fā)生中具有顯著性關(guān)聯(lián)且在女性中關(guān)聯(lián)更顯著；2）只有g(shù)lutamate單獨(dú)在男性冠心病事件發(fā)生中顯著關(guān)聯(lián)；3）Wald test檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)性別與hydroxy-PCs間的相互作用顯著 (P for interaction <0.001)。
 

此外，如圖2所示，將這8個(gè)代謝物與心血管疾病臨床標(biāo)記物等臨床指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析意外發(fā)現(xiàn)，氧化性脂類（C34:2 hydroxy-PC, C36:4 hydroxy-PC, 5-HETE, 15-HETE, and 11-HETE）與 CRP、LPA、Lipoprotein-associated phospholipase A2 activity MASS 指標(biāo)無顯著性相關(guān)性。
 

圖2. 代謝物與心血管疾病標(biāo)記物等臨床指標(biāo)間的斯皮爾曼相關(guān)性分析。Left, Spearman correlations are shown on the bottom and confidence interval on the top. Right, Heat map. Both figures are ordered by using hierarchical clustering. ACT indicates Lp-PLA2 activity; BMI, body mass index; BNP, N-terminal pro- brain natriuretic peptide; CMP, cytidine monophosphate; CRP, log C-reactive protein; HETE, hydroxyeicosatetraenoic acid; HDL, high-density lipoprotein; LPA, lipoprotein(a); MASS, Lipoprotein-associated phospholipase A2 mass; SBP, systolic blood pressure; and TCHL, total cholesterol.

為了研究371個(gè)代謝物間的相關(guān)性，使用偏相關(guān)分析校正“是否患冠心病”這個(gè)協(xié)變量，以 |偏相關(guān)系數(shù)| >0.7為條件，發(fā)現(xiàn)有6個(gè)cluster物質(zhì)聚類間的關(guān)聯(lián)與冠心病相關(guān)，如圖3所示的一個(gè)cluster包含了氧化性脂質(zhì)，且都是上述研究發(fā)現(xiàn)的與冠心病事件發(fā)生顯著性關(guān)聯(lián)的2 個(gè)hydroxy-PCs 和4 個(gè)HETEs，該cluster與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)（P=3.185E-07） 。

百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，在該cluster中，以CHD臨床風(fēng)險(xiǎn)因子為協(xié)變量校正發(fā)現(xiàn)有3個(gè)物質(zhì)仍然與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)，以樣本篩選匹配的變量為協(xié)變量校正發(fā)現(xiàn)只有1個(gè)物質(zhì)（12-HETE）與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)（校正后P<0.05）。
 

圖3. 六個(gè)氧化脂類間的偏相關(guān)斯皮爾曼相關(guān)性分析。Enrichment P value=3.185E-07. All markers are positively associated with increased CHD risk. All correlations (edges) are positive. CHD indicates coronary heart disease; HETE, hydroxyeicosatetraenoic acid; OH-PC, hydroxy-phosphatidyl- choline; and OR, odds ratio.

綜上所述，通過對(duì)WHI-OS和WHI-HT兩個(gè)人群隊(duì)列中絕經(jīng)女性的血漿代謝組學(xué)進(jìn)行相互的獨(dú)立驗(yàn)證研究，發(fā)現(xiàn)新的與冠心病事件發(fā)生顯著性相關(guān)的代謝物（如hydroxy-PCs，HETEs，glutamate，glutamine），且在PREDIMED人群隊(duì)列中再次驗(yàn)證表明C34:2 hydroxy-PC物質(zhì)與性別和冠心病事件發(fā)生具有顯著性關(guān)聯(lián)，百趣代謝組學(xué)文獻(xiàn)分享，這些結(jié)果為氧化脂質(zhì)與冠心病的相互關(guān)聯(lián)提供了數(shù)據(jù)支持和潛在靶點(diǎn)。