二代測序（NGS）是基于PCR和基因芯片技術，由一代測序發展而來的，可以平行測序的技術，具有通量高，速度更快的優點。在進行NGS實驗時，需要把樣本DNA提取之后，在進行建庫，然后上機測試，最后獲得數據后，進行生信分析。在測序整個流程中，對于樣本質量的要求非常高。低質量的DNA以及建庫產物，會影響到文庫轉化率，測序的深度，復雜性和均一性等指標。所以測序做的好不好，質控很重要。

圖 1 NGS建庫和質控流程示例

安捷倫質控儀器，例如2100生物分析儀，Tapestation系統和片段化分析儀等，均可以對NGS全流程進行質控。今天魯大師就帶著大家看看NGS質控要點。

測序樣本質控
· 基因組DNA
影響因素：儲存條件，例如溫度，儲存環境、提取方法
安捷倫獨創DIN值，數字化評判gDNA質控，使電泳圖的解釋更容易，便于樣品的比較，并為NGS技術提供了實驗的可重復性和高質量基因組DNA的定量

圖 2 使用安捷倫gDNA ScreenTape assay 分析gDNA，DIN值越大，gDNA質量越好

· RNA
轉錄組測序的樣本制備從提取RNA。RNA完整性對于下游建庫和測序尤為重要。

圖 3 使用片段化分析儀進行RNA 完整性分析. RQN為該儀器數字化評判RNA完整性的指標， RQN值越大，完整性越好。

RNA-seq cDNA合成
RNA-seq文庫制備的一個重要步驟是將mRNA從總RNA中分離出來，并通過逆轉錄將其轉化為cDNA(互補DNA)，用于后續的文庫制備步驟和測序。

圖 4 RNA-seq文庫的制備步驟通過安捷倫片段分析儀系統進行QC。顯示的是代表性步驟的電泳圖：單細胞(A)cDNA擴增。(B)cDNA擴增作為陽性對照。(C)A為陰性對照，無細胞。(D)最終的NGS庫

片段質量評估
目標DNA片段的大小是NGS文庫構建的關鍵因素。對核酸進行片段化的方法主要包括物理打斷和酶打斷。物理方法包括聲波剪切（和超聲，酶切方法包括非特異性內切酶和轉座酶片段化。根據需求，DNA片段長度可在150–800 bp之間。

圖 5 PCR擴增子片段到350~500bp大小，以獲得合適的測序樣本。使用安捷倫片段分析儀系統來評估碎片化的程度。(A)非片段PCR擴增子在964bp。(B)超聲打斷 C和D重復超聲打斷技術，顯示出廣泛的片段模式，峰值約為390bp，是下游測序的理想選擇

接頭連接
片段化后的DNA需要加上接頭。 接頭其實就是一段已知的短核苷酸序列，用于鏈接未知的目標測序片段。接頭添加方式不盡相同，但是接頭連接情況，我們可以通過安捷倫質控儀器進行檢測。

圖 6 使用安捷倫Tapestation系統的進行接頭連接的QC。(A)input DNA（紅色）和接頭（藍色）示意圖 (B)接頭在75bp處有一個峰值 (C)input DNA在165bp (D)以B和C為參考，四個峰值：接頭，input DNA,單端接頭，雙端接頭 (E)加號接頭的文庫最終產物和(F)pcr后帶有雙端接頭DNA插入片段示意圖

文庫最終產物質控
文庫制備的最后一步是需要進行PCR擴增，從而富集接頭連接的片段，產生足夠的文庫拷貝用于測序。良好的質控確保了高質量的文庫準備，確定最終文庫的大小、濃度和摩爾濃度。

兩大影響因素：
· 接頭二聚體
· 拷貝數大小

圖 7 使用安捷倫生物分析儀進行NGS文庫QC。(A)高質量文庫 (B)接頭二聚體約150bp的例子