正畸牙移動(OTM)是在牙周韌帶(PDL)和牙槽骨特異性位點重塑的壓力作用下發生的。一般來說，正畸治療對支持組織有積極的影響。然而，它可能導致有害的牙周反應，包括牙槽骨和軟組織結構的喪失，這可能對口腔康復構成相當大的挑戰。

壓力在直接和間接調節破骨細胞的骨穩態中起著至關重要的作用。據報道，壓力可以直接參與破骨細胞的生成。壓力還可以通過一些其他細胞（如 PDL 細胞）釋放的分子運輸作用于破骨細胞。PDL 細胞在 OTM 中受到壓力，釋放各種活性細胞因子，包括骨保護素 (OPG) 和核因子-κB 配體受體激活劑 (RANKL)，來影響破骨細胞以調節 OTM 過程。

自噬是一種進化上保守的物理分子過程，可降解細胞中不需要的或功能失調的細胞器。因此，自噬被認為是一種保護細胞存活和維持細胞穩態的機制。自噬通常以低水平發生在細胞中，以維持細胞器內環境的平衡，但在某些壓力條件下會上調。自噬在多種細胞中增加，例如人乳腺癌細胞系、軟骨細胞、椎間盤源性髓核細胞，以響應壓力作用。

早期的電子顯微鏡研究顯示，在 OTM 期間，位于正畸牙壓力側的 PDL 細胞中的自噬增加。此外，之前的研究還發現，自噬通過 RANKL 和 OPG 信號通路對骨質礦化和骨內穩態產生深遠影響。然而，自噬對 OTM 期間組織響應壓力反應的貢獻仍不清楚。

基于此，由上海同濟大學口腔醫學院正畸科、上海牙組織修復與再生工程技術研究中心的專家學者進行了合作研究，試圖探討PDL細胞是否通過壓力誘導的自噬來調節OTM過程中破骨細胞的生成。相關研究成果發表在 Journal of Periodontology 題為《Compressive force-induced autophagy in periodontal ligament cells downregulates osteoclastogenesis during tooth movement》。

實驗結果：

正畸力誘導PDL中的自噬

為了研究正畸力是否誘導自噬，建立了一個OTM模型（圖1 A）。正畸力側自噬關鍵蛋白LC3II/I和Beclin-1的表達水平高于對照組（圖1 B）。此外，實驗組中自噬標志物Atg5、Atg12、Atg8/LC3 mRNA表達水平也高于對照組（圖1 C）。免疫熒光染色進一步證實，施加正畸力后PDL細胞 LC3B和Beclin-1水平顯著升高（圖1 D、E）。

圖 1  在正畸力作用下，PDL 組織中的自噬增加

壓力調節PDL細胞中的自噬表達

為了確認PDL細胞是否激活了自噬，對PDL細胞施加壓力。首先，對 PDL 細胞施加 1.5 g/cm²的壓力作用 3、6、9、12 和 24 h 后，LC3II/I 和 Beclin-1 的表達水平在 3、6 和 9h時升高（圖2 B）。自噬標志物Atg5、Atg12和Atg8/LC3的mRNA表達水平也遵循類似的模式（圖2 C）。

然后，對 PDL 細胞施加 1.5、3.0 和 4.5 g/cm²的壓力作用 6 h后，LC3II/I 和 Beclin-1 的表達水平在 1.5 g/cm²壓力下顯著升高（圖2 D)。自噬標志物Atg5和Atg8/LC3的mRNA表達水平也遵循類似的模式（圖2 E）。

為了確定細胞自噬通量，取PDL細胞前用50µM氯喹處理4小時。壓力誘導的p62蛋白的表達減少，LC3II / I蛋白的表達增加，而用氯喹處理則誘導p62和LC3II/I蛋白的積累（圖2 F）。

接下來，用 mRFP-GFP-LC3 腺病毒處理 PDL 細胞。在 1.5 g/cm²壓力后，每個細胞的 mRFP 陽性自噬體和雙陽性自噬體的數量均顯著增加（圖2 G）。

在這項研究中，TEM 還用于確認壓力對自噬體和自噬溶酶體形成的影響。實驗發現，在1.5 g/cm²的壓力作用6小時后，PDL細胞胞質中自噬體和自噬溶酶體的數量更高（圖2 H）。

這些結果表明，PDL細胞在壓力和響應輕壓力作用下出現早期自噬。

圖 2   PDL 細胞中壓力誘導的自噬

自噬抑制 OTM，增加骨密度

為了探索自噬在 OTM 過程中的作用，向動物注射自噬抑制劑 3-MA 或自噬啟動子雷帕霉素。蛋白質印跡結果表明，在OTM模型中，3-MA可下調牙周組織的自噬，雷帕霉素可上調自噬。在 OTM 動物中觀察到牙齒移動距離增加。3-MA+ OTM 組的距離顯著大于 OTM 組。這表明自噬可以抑制OTM，并增加骨密度。

正畸力后自噬抑制破骨細胞生成

接下來進一步研究自噬如何影響破骨細胞生成，這兩者都直接參與牙齒移動過程中的骨重塑。向 OTM 動物注射 3-MA 和雷帕霉素，并觀察到在 3-MA 處理的 OTM 動物中 PDL 壓力側結構完整性喪失。然而，雷帕霉素的施用保護了 PDL 組織免受結構完整性的損失（圖3 A）。

與對照側相比，在OTM側，TRAP染色表明注射雷帕霉素顯著減少了破骨細胞的數量（圖3 B)。RT-PCR 顯示，在 OTM 期間，用 3-MA 處理的細胞中破骨細胞相關因子 CTSK、基質金屬蛋白酶-9、TRAP 和 RANKL/OPG 的 mRNA 表達水平顯著升高。與此相反，雷帕霉素下調了破骨細胞的活性（圖3 C）。

這些結果共同證明，自噬抑制了 OTM 中的破骨細胞的生成。

圖 3   自噬抑制 PDL 組織中破骨細胞的表達

壓力誘導的自噬抑制 RANKL/OPG 系統

為了進一步研究 PDL 細胞中自噬如何抑制破骨細胞活性的機制，實驗檢測了 RANKL/OPG 的表達水平。首先，研究了在壓力作用下RANKL / OPG的表達，發現其比例顯著增加，在6h時達到最高水平，然后下降（圖4 A、B）。

為了研究自噬對 RANKL/OPG 表達的影響，將 3-MA 和雷帕霉素注入 PDL 細胞，蛋白質印跡結果顯示 3-MA 下調 PDL 細胞的自噬，雷帕霉素上調自噬（圖4 C）。

然后，使用 ELISA 來測試培養的PDL細胞經6小時力加載后上清液中RANKL和OPG的蛋白水平。結果表明，在壓力作用6小時后，RANKL/OPG比值增加，而且在壓力下PDL細胞中3-MA進一步增加了該比值 (圖4 D)。

通過RT-PCR進一步發現，在1.5 g/cm²壓力作用6h下，PDL細胞中3-MA顯著上調，雷帕霉素顯著下調RANKL/OPG比值 (圖4 E)，這表明自噬可能通過自分泌和旁分泌機制調節 RANKL 和 OPG 表達之間的平衡，來負調控破骨細胞生成。

圖 4   自噬對 PDL 細胞中 RANKL 和 OPG 表達的影響

實驗結論：

PDL 細胞中的自噬在壓力作用下被激活，并通過抑制 RANKL/OPG 系統來調節破骨細胞活性。這項研究提供了第一個科學證據，表明自噬在牙齒移動過程中起作用。

這些發現增加了我們對牙齒移動過程中發生的動力學變化背后的生物機制的理解。此外，從研究中獲得的知識可能有助于未來設計新的治療方法。

參考文獻：Chen L, Mo S, Hua Y. Compressive force-induced autophagy in periodontal ligament cells downregulates osteoclastogenesis during tooth movement. J Periodontol. 2019 Oct;90(10):1170-1181. doi: 10.1002/JPER.19-0049. Epub 2019 Jun 2. PMID: 31077358.

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