小編當年第一次接觸激光共聚焦顯微鏡是在學校的公共平臺，當時覺得共聚焦果然不愧為成像神器，拍出的圖片好清楚啊。在第一次獨立預約使用之前，平臺的老師再三叮囑我，現有的設備配備了405、488、543、633四根激光器，在選擇熒光標記的時候，切記選擇合適的激發波長，才能夠獲得理想的結果。作為小白的我，自然謹遵教導，在師兄的指引下，用著實驗室常用的DAPI、FITC和TRITC標記細胞，成像效果還真不錯，除了拍久了熒光會慢慢淬滅。不過隨著儀器操作越來越熟練，動作越來越快，在樣品淬滅之前，完成拍圖還是不成問題的。

后來聽說共聚焦還能做分子間相互作用，用一個叫FRET的模塊就能夠實現，咨詢了平臺老師和閱讀了相關文獻之后，先是了解目前設備現有的FRET功能有FRET AB（受體漂白）和FRET SE（受激發射）兩種方法，而因為FRET SE法由于需要準備多種對照樣品，后期的計算也極為復雜，“聰明”的我自然選擇了相對容易的FRET AB方法，在選擇熒光標記的時候發現最常見的CFP和YFP作為供體-受體在我們這因為沒有合適的激光器沒法做，而我們最常用的FITC和TRITC又由于太容易被漂白不適合來做FRET AB實驗，最終在文獻中看到有Alexa 488和Alexa 568這樣一對供體-受體組合，Alexa系列染料向來以穩定性高、不容易淬滅著稱，看來最適合FRET AB實驗了，和老板軟磨硬泡了好幾次之后，終于同意下血本買了這兩個二抗。

買回來之后，發現這兩個熒光標記信號果然很強，穩定性也比之前的FITC、TRITC好多了，543nm的激光器激發Alexa 568雖然效率不是很高，但是把激光器能量打滿，檢測器的增益調高一點，信號還是很OK的。可做FRET AB的時候，卻發現本應發生FRET效應的兩個標記在漂白了Alexa 568之后，Alexa 488的信號并沒有增強，當時也是百思不得其解，再咨詢了其他有FRET經驗的老師，他們說，有時候二抗的空間構象也會影響FRET的效果，而且FRET AB的實驗結果確實也不太穩定，重復性也不高，好在當時通過其他的實驗方法驗證了我們研究的兩個蛋白確實有相互作用，這個數據不放進去也能夠說明問題，也就沒有過多的深究了。

畢業之后，進入了徠卡當了一名技術支持，接觸的東西多了，才發現隨著熒光蛋白的發現和不同熒光染料的開發，在做熒光成像的時候，有太多熒光標記可以選擇了，但很多客戶受限于購買共聚焦顯微鏡時選擇的有限的幾根激光譜線，導致有很多熒光標記無法使用，使得有時候在寬場熒光顯微鏡上能夠使用的染料在共聚焦上反倒效果不好了。

當時經典的激光光源通常僅提供單一的窄帶發射。有些氣體激光器可以同時發射幾種光線，最常見的例子就是氬離子激光器，在藍綠范圍內可以提供5條譜線（458、476、488、496、514 nm）。有些固體激光器雖然可以調節波長，但僅適用紅外波段（例如用于雙光子成像的Ti:Sa激光器），除了高度精密和極其昂貴之外，它們同一時間僅能發射單一波長的光線，而且調節波長的過程非常緩慢（需要好幾秒）。

到了2008年，徠卡基于其強大的研發能力和厚實的專利基礎，推出了第一款配備超連續光譜激光器的共聚焦顯微鏡TCS SP5X，可以選擇470-670nm范圍內任意波長作為激發譜線，好家伙，相當于一次性提供了足足201根激光器。借助200納米的自由調節激發線，可以讓當時絕大多數的染料發揮出最佳激發性能。這種靈活性對于需要為各種應用方向的用戶提供各種樣品和染料的成像平臺來說至關重要。不僅如此，借助專利的AOBS聲光分光器，能夠最多提供8條譜線同時激發。

在學習新產品的過程中，有一個案例讓我眼前一亮，這不就是我的例子么，要是當時遇見白激光這樣的神器，我也能成為案例里的“張三”了。來自于Genoa的Caorsi V和Diaspro A當時也是拿Alexa 488和Alexa 568這樣一對供體-受體組合做FRET AB，他們一開始也采用543nm的氦氖（HeNe）激光來漂白受體Alexa 488。根據公開的激發光譜數據顯示，供體Alexa 488對于543nm激光的吸收率足夠低（不到2%），因此不會干擾受體漂白。這二位和我一樣，實驗按照上述方法進行，結果沒有檢測到供體信號增加，因此可以得出結論，蛋白質并非“共定位”且至少相隔10納米。

然而不一樣的結局是，他們經過測試，發現在活體細胞中，供體Alexa 488對543nm的吸收率大約為11%，也就是說，用543nm漂白受體的時候，供體也會被漂白。而使用580nm激光對該受體進行相同實驗，供體發射增加了約三分之一，FRET效率達到了32%。580nm距離供體激發足夠遠，因此供體在受體漂白期間不會受到漂白，并可在FRET受體漂白后發出更多熒光（圖一）�？梢�使用白激光靈活調節激發波長的特性，能夠有效避開串色，從而獲得更精準的FRET結果。

圖一 FRET AB測量。FRET效率可以通過測量受體光漂白之后的供體發射增加獲得。上圖：在使用傳統激光器時，供體發射沒有增加（左側的綠色圖片）；下圖：受體采用白激光將波長調節到580nm漂白受體后，供體熒光明顯增強（圖片來自：Caorsi V, Diaspro A, Genoa）

看到自家的產品解決了當年困擾自己的難題，既遺憾當初我怎么沒碰到這么好的機遇，又慶幸技術的突破給眾多科學工作者帶來了解決問題的曙光。

白激光除了精準激發、有效避免串色之外，還有很多特性和應用。敬請期待我們后續的推送吧。
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