2020年伊始，突如其來的新冠疫情牽動著每個人的心。自武漢衛健委首發肺炎疫情情況通報后的短短一個星期，新型冠狀病毒就在實驗室中被檢出，并獲得了該病毒的全基因組序列。如此快速地確定病原體搶占研究先機，宏基因組測序技術功不可沒。
 

宏基因組學(Metagenomics)，以環境樣品中的微生物群體為研究對象，無需純化培養，能夠直接研究自然狀態下的微生物群落。通過直接從環境樣品中提取全部微生物的DNA，構建宏基因組文庫，利用基因組學的研究策略可以快速獲得微生物基因序列、多樣性、種群結構、進化關系、功能活性等信息。

圖片來源：Fields, Science. 2001, 291, 5507: 1221-1224
 

隨著基因測序技術的迅猛發展，基于二代測序的宏基因組學能夠幫助研究人員快速準確的得到大量微生物基因組數據和信息，宏基因組學研究已從分析少量樣品迅速發展為對大規模樣品的分析。那么隨之而來的，可能就是經費的限制問題了。很多實驗室已經通過實驗體系微縮化的方法，來節約試劑和input成本。來自加州大學圣地亞哥分校的研究人員，使用SPT Labtech的自動化液體處理平臺mosquito進行宏基因組測序文庫構建，在KAPA HyperPlus試劑盒標準反應體系縮小了1/10的條件下，依然可以得到高質量的組裝結果。對于多樣性較高的宏基因組樣本，依然保證了其基因組的復雜性。

10倍微縮化Kapa HyperPlus文庫構建策略
 

微生物高通量測序：mosquito genomics“微”你而來

 在微生物高通量測序領域，對于一些珍貴的微生物含量稀少的樣本，如何精準移液一直是科學家們想要解決的問題，現在小于0.5μL的移液量，普通移液槍已經很難完成精確操作了。SPT Labtech公司（前身為TTP Labtech）的mosquito是全球最受歡迎的納升級移液工作站之一，它擁有獨有的固相置換技術，可以無視任何黏度的試劑或DNA，可對500nL-5μL (HV設備)或25nL to 1.2μL (LV設備)樣品進行精確加樣。

     

在微生物擴增子測序及宏基因組測序中，使用mosquito進行文庫構建可以節省大約1/10的建庫試劑成本。不論是源板還是槍頭的死體積極低，不會造成試劑額外的浪費，一次性槍頭自動替換，有效避免樣本的交叉污染，靈活、準確、高效的特性使它成為眾多微生物基因組學研究實驗室所鐘愛的設備。

1、馬里蘭大學醫學院微生物組服務實驗室是如何實現降低16S 測序試劑成本并提高產量的?

     mosquito的使用非常靈活，能與多種自動化設備進行整合。在馬里蘭大學醫學院基因組學研究所微生物組學服務實驗室的NGS實驗流程中，通過整合mosquito以及其他大型高通量設備，實現了整個流程的自動化。

微生物擴增子測序文庫構建微縮化流程

       “我們中心的核心工作就是做微生物測序，處理各種各樣與疾病或者環境有關的微生物樣本， mosquito和我們實驗流程很好的整合在一起，我們用它來進行文庫制備，降低了樣本用量，儀器不論是軟件編程，還是使用起來都非常方便，以前我們在做測序的時候會浪費比較多的試劑，mosquito給我們帶來的好處是，我們能用更少的材料去做實驗，就可以拿到我們需要的結果，它速度很快，幾分鐘就能完成一快板，又快又省經費。”

——Mike Humphrys 馬里蘭大學微生物實驗室主任

2、mosquito助力Cell雜志重磅研究：腸道菌群或是自閉癥發病與治療的關鍵環節！

      來自加州理工學院的研究人員在Cell雜志上發表了題為Human Gut Microbiota from Autism Spectrum Disorder Promote Behavioral Symptoms in Mice的論文。發現腸道菌群可通過生成具有神經活性的代謝產物而調控小鼠的行為，本研究選取自閉癥患者和正常個體的腸道菌群移植入無菌小鼠腸道中，對本體及其后代小鼠的行為學特征及組織樣本進行分析。攜帶有自閉癥患者腸道菌群的小鼠(ASD小鼠)表現出明顯的類自閉癥癥狀。

      為鑒別影響小鼠自閉癥行為的關鍵菌種，研究者對自閉癥患者的腸道菌群、移植小鼠及其后代的腸道菌群類別進行了系統分析，該研究中，使用mosquito進行了10倍微縮化的宏基因測序文庫構建工作。研究發現自閉癥患者及ASD小鼠的腸道菌群與對照組有明顯差異。其中，正常個體/小鼠中卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)和糞副擬桿菌(Parabacteroides merdae)有明顯富集；而自閉癥個體/小鼠中毛螺菌科的菌種(Lachnospiraceae)則明顯多于對照組。提示了特定類型的腸道菌群或是引起自閉癥相關癥狀的重要環節。

腸道菌群移植小鼠模型中有明顯差異的菌種

3、病原微生物檢測：mosquito搞定18倍微縮化NGS文庫定量！

   
  在Microbiome雜志發表的一項名為Detecting eukaryotic microbiota with single-cell sensitivity in human tissue的研究中，來自劍橋大學的研究人員對先兆子癇妊娠結局不良人群（n  = 199）和健康對照人群（n  = 99）的胎盤細胞進行改進的18S擴增子測序，使其能夠在超過70,000個人細胞中檢測到惡性瘧原蟲，釀酒酵母或弓形蟲的等病原微生物單個基因組拷貝。其中使用了mosquito對18S擴增子文庫進行質檢，并把Biotium AccuClear dsDNA quantitation試劑盒體系縮小了18倍。使用這種方法，研究院人員無法在胎盤活檢中檢測到真核病原體生物。說明胎盤的真核感染不是上述妊娠并發癥的根本原因。這種病原微生物的檢測方法也為感染性疾病的臨床診斷提供了方法參考。

結束語
 

      就在近日，宏基因組測序再度在疾病研究中發揮作用。3月4日，北京地壇醫院對新冠肺炎患者采集的腦脊液標本進行宏基因組二代測序、鑒定可能的感染病原體過程中，獲得了SARS-CoV-2病毒基因組序列，首次證實病毒攻擊中樞神經系統的病例。
 

     宏基因組測序是微生物領域研究的強有力工具。mosquito用無與倫比的性能和通用性，為基因組學研究實驗室提供低成本、高效率的NGS建庫方案。

參考文獻：

Sanders, J. G. et al. Optimizing sequencing protocols for leaderboard metagenomics by combining long and short reads. Genome Biol. 20, 1–14 (2019)

Sharon, G.; Cruz, N.J.; Kang, D.W.; et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell 2019, 177, 1600–1618.

Susanne, Lager, Marcus, et al. Detecting eukaryotic microbiota with single-cell sensitivity in human tissue.[J]. Microbiome, 2018.