質粒提取的方法和影響因素

瀏覽次數：6597　發布日期：2019-10-31　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

質粒提取，您真的了解它嗎？

質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或者表達的重要媒介，這種基因運載工具在基因工程中具有極廣泛的應用價值，質粒提取是分子生物學最常見的實驗之一。目前質粒提取實驗大多借助試劑盒來完成，那么關于質粒提取的原理，您的了解足夠深入嗎？

目前，質粒提取試劑盒最常用的方法是堿裂解法。堿裂解法原理：根據共價閉合環狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結構被破壞而發生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環狀質粒DNA也會發生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環狀質粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物。這樣，通過離心可沉淀大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，再采用吸附柱對質粒進行吸附、去雜質、洗脫，就完成了質粒提取的實驗。

在進行質粒提取實驗室，有時候質粒提取的濃度不高，達不到后續進行轉化或轉染的實驗要求，那么可能是哪些原因造成的呢？下面跟隨星博士一起來看一下質粒提取有哪些影響因素吧！了解它的影響因素，就能夠做出相應的實驗方案調整，從而得到更高濃度的質粒樣本啦！

影響質粒提取的因素：

質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養條件、細胞的裂解、質�？截悢�、質粒的穩定性、抗生素等。

宿主菌的種類和培養條件

多數情況下宿主菌為大腸桿菌，而菌株的不同會影響質粒提取的質量。例如，HB101及其衍生菌株（TG1、JM系列）會在裂解時產生大量的糖類，如果沒有完全去除，將抑制后續實驗中的酶活性，影響質粒DNA提取的質量。

由于無質粒的子細胞在無抗生素時復制速度遠大于含質粒的細胞。因此，宿主菌株接種到液體培養基中培養的過程中，務必加入抗生素進行篩選。宿主菌接種到含相應抗生素的液體培養基中，振蕩培養12-16小時，不應超過16小時。超過16小時后，細胞開始裂解，使得質粒的得率降低，也可能導致質粒丟失或質粒變異。

不同質粒間的差異

質粒提取最終的濃度，最重要的影響因素之一就是質�？截悢�。質�？截悢凳侵干L在標準的培養基下每個細菌細胞中所含有的質粒DNA分子的數目，每個細菌中的質粒的拷貝數主要決定于質粒本身的復制特性。

按照復制機制，可以把質粒分為兩類：一類是嚴緊型質粒，當細菌染色體復制一次時，質粒也復制一次，每個細菌內只含1-2個質粒；另一類是松弛型質粒，當細菌染色體復制停止后仍然能繼續復制，每一個細菌內一般含20個左右質�？截�，這些質粒的復制是在寄主的松弛控制之下的。高拷貝質粒與低拷貝質粒在相同條件下進行質粒提取，高拷貝質粒濃度會高于低拷貝質粒的濃度。不同拷貝數的質粒，菌液量的需求不同，對于低拷貝的質粒，要相應增加菌液的量。

在細菌培養液中加入氯霉素可提高松弛型質粒的拷貝數。因為氯霉素能抑制宿主細胞蛋白質和DNA的合成，但對松弛型質粒的復制沒有影響。由于氯霉素抑制了宿主細胞蛋白質和DNA的合成，從而抑制了染色體的復制，但質粒復制所用的酶半衰期較長，故質粒仍可繼續復制，這樣既可增加質粒產量，又可降低細胞的數量，使細菌裂解液的粘度降低而便于操作。氯霉素的使用濃度為20-170ug/ml，使用氯霉素能在一定程度上提高質粒提取的濃度。

質粒鑒定與評價：

瓊脂糖電泳檢測：

堿裂解法提取的質粒經瓊脂糖電泳進行鑒定時，理想狀況是只出現超螺旋—條帶，但在質粒提取過程中，由于機械力、酸堿度、試劑等原因，使質粒DNA鏈發生斷裂，可能出現兩條帶或者出現三條帶，這三條帶電泳遷移率從快到慢，分別是超螺旋、開環和復制中間體(即沒有復制完全的兩個質粒粘連在—起)。

如果加溶液Ⅱ后過度振蕩，會在遠離這三條帶的位置出現條帶，這條帶泳動得較慢，是大腸桿菌基因組DNA的片斷，因此要注意加完P2、P3后輕柔混勻。質粒提取是否有基因組污染，可以進行單酶切驗證，酶切后有單一條帶，就證明質粒提取的產物是單一的。

濃度及純度測定：

用紫外線分光光度計檢測濃度測定標準為：OD 260 值為1相當于大約50ug/ml雙鏈DNA。OD 260 /OD 280 比值在1.7-1.9之間說明所得DNA純度較好。OD 260 /OD 280 比值若低于1.7說明可能有蛋白污染。OD 260 /OD 280 比值若高于2.0則說明DNA有可能已降解。