單細胞提取與質譜聯用的新型無損提取檢測技術
單細胞代謝組學分析能夠為對細胞功能分析提供諸多幫助。但是受制于測試條件問題，所得到的結果一直并不理想。隨著質譜與單細胞提取手段的發展，目前已經出現了多種不同的提取方法。本文就基于FluidFM提取技術和MALDITOF聯用的新型無損提取測試技術進行簡述。
眾所周知由于細胞異質性的存在，使得每個細胞的實際結構、功能都不完全相同，因此對于單細胞層面的研究變得十分具有意義。當前單細胞測序、轉錄技術已經發展的較為完備，具有比較成熟的模型。但是單細胞代謝組學的研究卻仍處于起步階段，因為細胞的代謝是十分復雜的。這不僅是細胞內代謝的化學成分種類多，濃度低，并且標記很有可能導致其生物功能被干擾改變。因此使用高靈敏質譜的測量策略有可能解決這一問題。
除了檢測儀器，提取手段在檢測過程中也起到十分重要的地位。目前的提取主要手段是將細胞消化、懸浮，然后進行裂解得到內容。這種方法需要將細胞懸浮并使用酶進行裂解。這一過程改變了細胞生存的環境，將無法避免的對細胞內部代謝物產生破壞性的影響。此外由于單個細胞的改變也將不可避免的對周邊的細胞產生未知的影響。因此能夠使用原位提取，在不破壞細胞結構、活力的條件下抽取內容的方法，將極大地幫助研究者得到最為原始的信息。然而直到目前，仍沒有理想的方法能夠在不破壞細胞情況下進行提取。本文就通過使用FluidFM 技術進行單細胞活體提取并聯用質譜進行代謝物的檢測進行闡述。
由于先前已經有CELL 報道了使用FluidFM 技術進行活體提取的方法，本文作者通過研究這篇作者的工作，開發了一套適合MALDI-TOF 質譜的分析方法，如圖1 所示，并證實這種方法具有很高的靈敏度。
圖1，使用FluidFM 和MALDI-TOF 聯用的單細胞質譜分析。（A）單細胞提取示意圖；（B）將提取物放在MAMS 孔中；（C）噴灑9AA matrix 覆蓋表面；（D）MALDI-TOF 質譜分析。
作者通過使用直接購買的400 nm 孔徑的FluidFM 探針成功從預先使用GFP-HeLa 細胞中提取出0.8~2.7 pL 的細胞質，一方面確保細胞存活，一方面足夠用于檢測。隨后將細胞提取物放置在質譜專用的95 μm microarrays 上，并立即吹干，以猝滅酶的活性，如圖2 所示。
圖2，HeLa細胞活體提取過程。（A）提取前；（B）提取中；（C）提取后；（D）細胞質提儲存在探針中；（E）移動到MAMS孔上；（F）釋放提取液。
隨后將9AA 噴涂在microarrays 表面，并放入質譜檢測。結果如圖3 所示。他們成功通過這種方法檢測到了各種酸類和磷酸類化合物，包括核糖核苷酸（cGMP）、UDP、ADP、ATP、活性糖(UDP-GlcNAc、UDP-Glc)、氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、谷胱甘肽。
圖3，直接提取的HeLa 細胞質的代謝產物MS 分析結果。
隨后他們使用C13 標記的葡萄糖對細胞進行培養48h 并對細胞進行提取檢測，如圖4 所示。
圖4，U-C13 標記的葡萄糖培養的HeLa 細胞的代謝產物結果。
一般來說質譜檢測一般化合物的同位素峰往往以+1 為主。而U-13C 的主體骨架均已使用C13 標記，因此同位素累積高的物質即為代謝的主要產物。從結果上看同位素累計主要出現在核苷酸和活化糖上面，而谷氨酸和谷胱甘肽并沒有出現同位素累積。這說明谷氨酸和谷胱甘肽來源于培養基，而葡萄糖主要通過糖磷酸途徑合成活性糖和核酸。如圖5 所示。
圖5，U-13C標記和天然的HeLa代謝產物的分析。箭頭表示代謝物的峰。*谷胱甘肽峰。**13C UDP GLCNAC的 [M＋13- H]-峰。
總結：
本文通過一種全新的方式，實現了從活細胞中直接提取細胞質研究代謝產物的方法。通過這種方法能夠讓研究者在不殺死細胞，不改變細胞周邊環境的條件下研究細胞最原始的代謝信息，并給持續監測同一個細胞提供了可能。相信在不久的將來使用FluidFM 技術提取技術將會幫助研究者更好的克服單細胞提取障礙，讓研究者得到更加可靠、精準的單細胞信息。
本文通過一種全新的方式，實現了從活細胞中直接提取細胞質研究代謝產物的方法。通過這種方法能夠讓研究者在不殺死細胞，不改變細胞周邊環境的條件下研究細胞最原始的代謝信息，并給持續監測同一個細胞提供了可能。相信在不久的將來使用FluidFM 技術提取技術將會幫助研究者更好的克服單細胞提取障礙，讓研究者得到更加可靠、精準的單細胞信息。
多功能單細胞顯微操作系統——瑞士 Cytosurge FluidFM BOT
產品簡介：
多功能單細胞顯微操作系統--FluidFM BOT，是將原子力系統、微流控系統、細胞培養系統為一體的單細胞操作系統。主要功能包括單細胞注射、單細胞提取以及單細胞分離。
FluidFM BOT極大的方便了單細胞水平的研究，尤其適合應用于精準醫療、單細胞生物學、單細胞質譜、單細胞基因編輯、藥物研發等領域。
多功能單細胞顯微操作系統--FluidFM BOT，是將原子力系統、微流控系統、細胞培養系統為一體的單細胞操作系統。主要功能包括單細胞注射、單細胞提取以及單細胞分離。
FluidFM BOT極大的方便了單細胞水平的研究，尤其適合應用于精準醫療、單細胞生物學、單細胞質譜、單細胞基因編輯、藥物研發等領域。
注射、提取、分選一體化的單細胞操縱解決方案
參考文獻：
(1) Tang, F. C.; Lao, K. Q.; Surani, M. A. Nat. Methods 2011, 8 (4), S6-S11.
(2) Fessenden, M. Nature 2016, 540 (7631), 153-155.
(3) Zenobi, R. Science 2013, 342 (6163), 1243259.
(4) Pan, Z. Z.; Raftery, D. Anal. Bioanal. Chem. 2007, 387 (2), 525-527.
(5) Svatos, A. Anal. Chem. 2011, 83 (13), 5037-5044.
(6) Bowen, B. P.; Northen, T. R. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2010, 21 (9), 1471-1476.
(7) Heinemann, M.; Zenobi, R. Curr. Opin. Biotechnol. 2011, 22 (1), 26-31.
(8) Amantonico, A.; Oh, J. Y.; Sobek, J.; Heinemann, M.; Zenobi, R. Angew. Chem. Int. Edit.2008, 47 (29), 5382-5385.
(9) Martano, G.; Delmotte, N.; Kiefer, P.; Christen, P.; Kentner, D.; Bumann, D.; Vorholt, J. A.Nat. Protoc. 2015, 10 (1), 1-11.
(10) Tachibana, C. Science 2014, 345, 1519-1521.
(11) Nemes, P.; Knolhoff, A. M.; Rubakhin, S. S.; Sweedler, J. V. Anal. Chem. 2011, 83 (17),6810-6817.
(12) Nemes, P.; Knolhoff, A. M.; Rubakhin, S. S.; Sweedler, J. V. ACS Chem. Neurosci. 2012,3 (10), 782-792.
(13) Ong, T. H.; Kissick, D. J.; Jansson, E. T.; Comi, T. J.; Romanova, E. V.; Rubakhin, S. S.;Sweedler, J. V. Anal. Chem. 2015, 87 (14), 7036-7042.
(14) Janson, E. T.; Comi, T. J.; Rubakhin, S. S.; Sweedler, J. V. ACS Chem. Biol. 2016, 11 (9),2588-2595.
(15) Urban, P. L.; Jefimovs, K.; Amantonico, A.; Fagerer, S. R.; Schmid, T.; Madler, S.;Puigmarti-Luis, J.; Goedecke, N.; Zenobi, R. Lab Chip 2010, 10 (23), 3206-3209.
(16) Ibanez, A. J.; Fagerer, S. R.; Schmidt, A. M.; Urban, P. L.; Jefimovs, K.; Geiger, P.;Dechant, R.; Heinemann, M.; Zenobi, R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013, 110 (22), 8790-8794.
(17) Krismer, J.; Steinhoff, R. F.; Zenobi, R. Chimia 2016, 70 (4), 236-239.
(18) Masujima, T. Anal. Sci. 2009, 25 (8), 953-960.
(19) Date, S.; Mizuno, H.; Tsuyama, N.; Harada, T.; Masujima, T. Anal. Sci. 2012, 28 (3),201-203.
(20) Fukano, Y.; Tsuyama, N.; Mizuno, H.; Date, S.; Takano, M.; Masujima, T. Nanomedicine 2012, 7 (9), 1365-1374.
(21) Mizuno, H.; Tsuyama, N.; Date, S.; Harada, T.; Masujima, T. Anal. Sci. 2008, 24 (12),1525-1527.
(22) Esaki, T.; Masujima, T. Anal. Sci. 2015, 31 (12), 1211-1213.
(23) Gong, X. Y.; Zhao, Y. Y.; Cai, S. Q.; Fu, S. J.; Yang, C. D.; Zhang, S. C.; Zhang, X. R. Anal. Chem. 2014, 86 (8), 3809-3816.
(24) Pan, N.; Rao, W.; Kothapalli, N. R.; Liu, R. M.; Burgett, A. W. G.; Yang, Z. B. Anal. Chem. 2014, 86 (19), 9376-9380.
(25) Zhang, L. W.; Vertes, A. Anal. Chem. 2015, 87 (20), 10397-10405.
(26) Aerts, J. T.; Louis, K. R.; Crandall, S. R.; Govindaiah, G.; Cox, C. L.; Sweedler, J. V. Anal. Chem. 2014, 86 (6), 3203-3208.
(27) Guillaume-Gentil, O.; Grindberg, R. V.; Kooger, R.; Dorwling-Carter, L.; Martinez, V.; Ossola, D.; Pilhofer, M.; Zambelli, T.; Vorholt, J. A. Cell 2016, 166 (2), 506-516.
(28) Meister, A.; Gabi, M.; Behr, P.; Studer, P.; Voros, J.; Niedermann, P.; Bitterli, J.; Polesel-Maris, J.; Liley, M.; Heinzelmann, H.; Zambelli, T. Nano Lett. 2009, 9 (6), 2501-2507.
(29) Guillaume-Gentil, O.; Potthoff, E.; Ossola, D.; Franz, C. M.; Zambelli, T.; Vorholt, J. A. Trends Biotechnol. 2014, 32 (7), 381-388.
(30) Guillaume-Gentil, O.; Potthoff, E.; Ossola, D.; Dorig, P.; Zambelli, T.; Vorholt, J. A. Small 2013, 9 (11), 1904-1907.
(31) Schmidt, A. M.; Fagerer, S. R.; Jefimovs, K.; Buettner, F.; Marro, C.; Siringil, E. C.; Boehlen, K. L.; Pabst, M.; Ibanez, A. J. Analyst 2014, 139 (22), 5709-5717.
(32) Jeffries, N. Bioinformatics 2005, 21 (14), 3066-3073.
(33) Vermillion-Salsbury, R. L.; Hercules, D. M. Rapid Commun. Mass Sp. 2002, 16 (16), 1575-1581.
(34) Kentner, D.; Martano, G.; Callon, M.; Chiquet, P.; Brodmann, M.; Burton, O.; Wahlander, A.; Nanni, P.; Delmotte, N.; Grossmann, J.; Limenitakis, J.; Schlapbach, R.; Kiefer, P.; Vorholt, J. A.; Hiller, S.; Bumann, D. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2014, 111 (27),9929-9934.
(35) Chen, Y. J.; Huang, X. J.; Mahieu, N. G.; Cho, K.; Schaefer, J.; Patti, G. J. Biochemistry 2014, 53 (29), 4755-4757.
(36) Actis, P.; Maalouf, M. M.; Kim, H. J.; Lohith, A.; Vilozny, B.; Seger, R. A.; Pourmand, N. ACS Nano 2014, 8 (1), 546-553.
(1) Tang, F. C.; Lao, K. Q.; Surani, M. A. Nat. Methods 2011, 8 (4), S6-S11.
(2) Fessenden, M. Nature 2016, 540 (7631), 153-155.
(3) Zenobi, R. Science 2013, 342 (6163), 1243259.
(4) Pan, Z. Z.; Raftery, D. Anal. Bioanal. Chem. 2007, 387 (2), 525-527.
(5) Svatos, A. Anal. Chem. 2011, 83 (13), 5037-5044.
(6) Bowen, B. P.; Northen, T. R. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2010, 21 (9), 1471-1476.
(7) Heinemann, M.; Zenobi, R. Curr. Opin. Biotechnol. 2011, 22 (1), 26-31.
(8) Amantonico, A.; Oh, J. Y.; Sobek, J.; Heinemann, M.; Zenobi, R. Angew. Chem. Int. Edit.2008, 47 (29), 5382-5385.
(9) Martano, G.; Delmotte, N.; Kiefer, P.; Christen, P.; Kentner, D.; Bumann, D.; Vorholt, J. A.Nat. Protoc. 2015, 10 (1), 1-11.
(10) Tachibana, C. Science 2014, 345, 1519-1521.
(11) Nemes, P.; Knolhoff, A. M.; Rubakhin, S. S.; Sweedler, J. V. Anal. Chem. 2011, 83 (17),6810-6817.
(12) Nemes, P.; Knolhoff, A. M.; Rubakhin, S. S.; Sweedler, J. V. ACS Chem. Neurosci. 2012,3 (10), 782-792.
(13) Ong, T. H.; Kissick, D. J.; Jansson, E. T.; Comi, T. J.; Romanova, E. V.; Rubakhin, S. S.;Sweedler, J. V. Anal. Chem. 2015, 87 (14), 7036-7042.
(14) Janson, E. T.; Comi, T. J.; Rubakhin, S. S.; Sweedler, J. V. ACS Chem. Biol. 2016, 11 (9),2588-2595.
(15) Urban, P. L.; Jefimovs, K.; Amantonico, A.; Fagerer, S. R.; Schmid, T.; Madler, S.;Puigmarti-Luis, J.; Goedecke, N.; Zenobi, R. Lab Chip 2010, 10 (23), 3206-3209.
(16) Ibanez, A. J.; Fagerer, S. R.; Schmidt, A. M.; Urban, P. L.; Jefimovs, K.; Geiger, P.;Dechant, R.; Heinemann, M.; Zenobi, R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013, 110 (22), 8790-8794.
(17) Krismer, J.; Steinhoff, R. F.; Zenobi, R. Chimia 2016, 70 (4), 236-239.
(18) Masujima, T. Anal. Sci. 2009, 25 (8), 953-960.
(19) Date, S.; Mizuno, H.; Tsuyama, N.; Harada, T.; Masujima, T. Anal. Sci. 2012, 28 (3),201-203.
(20) Fukano, Y.; Tsuyama, N.; Mizuno, H.; Date, S.; Takano, M.; Masujima, T. Nanomedicine 2012, 7 (9), 1365-1374.
(21) Mizuno, H.; Tsuyama, N.; Date, S.; Harada, T.; Masujima, T. Anal. Sci. 2008, 24 (12),1525-1527.
(22) Esaki, T.; Masujima, T. Anal. Sci. 2015, 31 (12), 1211-1213.
(23) Gong, X. Y.; Zhao, Y. Y.; Cai, S. Q.; Fu, S. J.; Yang, C. D.; Zhang, S. C.; Zhang, X. R. Anal. Chem. 2014, 86 (8), 3809-3816.
(24) Pan, N.; Rao, W.; Kothapalli, N. R.; Liu, R. M.; Burgett, A. W. G.; Yang, Z. B. Anal. Chem. 2014, 86 (19), 9376-9380.
(25) Zhang, L. W.; Vertes, A. Anal. Chem. 2015, 87 (20), 10397-10405.
(26) Aerts, J. T.; Louis, K. R.; Crandall, S. R.; Govindaiah, G.; Cox, C. L.; Sweedler, J. V. Anal. Chem. 2014, 86 (6), 3203-3208.
(27) Guillaume-Gentil, O.; Grindberg, R. V.; Kooger, R.; Dorwling-Carter, L.; Martinez, V.; Ossola, D.; Pilhofer, M.; Zambelli, T.; Vorholt, J. A. Cell 2016, 166 (2), 506-516.
(28) Meister, A.; Gabi, M.; Behr, P.; Studer, P.; Voros, J.; Niedermann, P.; Bitterli, J.; Polesel-Maris, J.; Liley, M.; Heinzelmann, H.; Zambelli, T. Nano Lett. 2009, 9 (6), 2501-2507.
(29) Guillaume-Gentil, O.; Potthoff, E.; Ossola, D.; Franz, C. M.; Zambelli, T.; Vorholt, J. A. Trends Biotechnol. 2014, 32 (7), 381-388.
(30) Guillaume-Gentil, O.; Potthoff, E.; Ossola, D.; Dorig, P.; Zambelli, T.; Vorholt, J. A. Small 2013, 9 (11), 1904-1907.
(31) Schmidt, A. M.; Fagerer, S. R.; Jefimovs, K.; Buettner, F.; Marro, C.; Siringil, E. C.; Boehlen, K. L.; Pabst, M.; Ibanez, A. J. Analyst 2014, 139 (22), 5709-5717.
(32) Jeffries, N. Bioinformatics 2005, 21 (14), 3066-3073.
(33) Vermillion-Salsbury, R. L.; Hercules, D. M. Rapid Commun. Mass Sp. 2002, 16 (16), 1575-1581.
(34) Kentner, D.; Martano, G.; Callon, M.; Chiquet, P.; Brodmann, M.; Burton, O.; Wahlander, A.; Nanni, P.; Delmotte, N.; Grossmann, J.; Limenitakis, J.; Schlapbach, R.; Kiefer, P.; Vorholt, J. A.; Hiller, S.; Bumann, D. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2014, 111 (27),9929-9934.
(35) Chen, Y. J.; Huang, X. J.; Mahieu, N. G.; Cho, K.; Schaefer, J.; Patti, G. J. Biochemistry 2014, 53 (29), 4755-4757.
(36) Actis, P.; Maalouf, M. M.; Kim, H. J.; Lohith, A.; Vilozny, B.; Seger, R. A.; Pourmand, N. ACS Nano 2014, 8 (1), 546-553.
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