志賀氏菌核酸檢測試劑盒（一管式PCR-熒光探針法）

◆ 產(chǎn)品說明

致病菌檢測系列可針對食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進行擴增，儀器實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號變化，自動判讀結(jié)果。本產(chǎn)品用于志賀氏菌的檢測。檢出限為10³ CFU/ml。

◆ 產(chǎn)品組成（96測試）

◆ 適用儀器

   ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等實時熒光PCR儀。

◆ 自備耗材和儀器

①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；③離心機；④渦旋混勻器；⑤金屬浴；⑥均質(zhì)機、攪拌機或研缽等研磨器具；⑦電子天平。

◆ 注意事項

1．本試劑檢測靈敏度高。為了防止污染，實驗要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：樣本制備區(qū)。

 2）第二區(qū)：模板添加區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2．實驗過程中穿戴工作服和乳膠手套，不同區(qū)域獨立使用工具，需更換手套和實驗服。

3．嚴格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請嚴格按照說明書要求在冰盒上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，推薦使用前離心30秒，并按檢測頻次將反應(yīng)液以適當體積分管保存。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴增管請置于密封袋內(nèi)丟棄，當日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號試劑請勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 樣品處理

參照《GB 4789.5-2012 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 志賀氏菌檢驗》中的5.1處理樣品，對樣品進行前增菌，制備的菌液保存待用。

以無菌操作取檢樣25 g（ml），加入裝有滅菌225 ml志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000 rpm/min～10000 rpm/min均質(zhì)；或加入裝有225 ml志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)1 min～2 min，液體樣品振蕩混勻即可。于41.5 ℃±1℃，厭氧培養(yǎng)16 h～20 h。

詳細步驟請按照標準操作或查閱食安通軟件。

◆ 實驗操作

1. 模板制備（樣本制備區(qū)）

建議使用試劑配套細菌組DNA提取系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。

2．添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進行）

剪下所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，向每管反應(yīng)液中分別加入5μL模板，順序為NG、待測樣品模板、PG-Shi-P。蓋好配套的PCR管蓋后，渦旋混勻30s，離心1min，立即進行PCR擴增反應(yīng)。

3. 擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）

使用熒光定量PCR儀，熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇TAMRA。

按下列條件設(shè)置擴增反應(yīng)：

4.基線和閾值設(shè)定

  基線調(diào)整取3-15個循環(huán)的熒光信號，閾值線應(yīng)超過陰性對照擴增曲線的最高點。

◆ 結(jié)果判定

檢測樣品無Ct值或≥40.0，曲線為直線或輕微斜線，無“S”型擴增曲線，可報告樣品陰性，不含有志賀氏菌或含量低于檢測限；

檢測樣品Ct≤35.0，曲線呈“S”型擴增曲線，可直接報告樣品陽性，含有志賀氏菌；

檢測樣品35.0＜Ct＜40.0，需進行一次重復(fù)實驗，若Ct值≥40.0則為陰性，否則為陽性。

• NG反應(yīng)為平滑直線，PG反應(yīng)為“S”型擴增曲線且Ct值＜30，此次檢測結(jié)果有效，否則無效。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為無效，請與技術(shù)支持人員聯(lián)系。
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