DAP-seq技術(shù)助力揭秘葡萄耐冷性的糖代謝調(diào)控機(jī)制
2025年4月8日，中國科學(xué)院武漢植物園辛海平研究員團(tuán)隊(duì)在Plant, Cell & Environment期刊(IF=6.1)上發(fā)表了題為“VaEIN3.1‐VaERF057‐VaFBA1 Module Positively Regulates Cold Tolerance by Accumulating Soluble Sugar in Grapevine”的研究論文，旨在揭示VaEIN3.1-VaERF057-VaFBA1模塊如何通過調(diào)控可溶性糖積累增強(qiáng)葡萄耐冷性，為抗逆分子育種提供新靶點(diǎn)。該研究利用DAP-seq技術(shù)，篩選出了VaERF057的下游靶基因。
研究背景
葡萄作為低溫敏感型經(jīng)濟(jì)作物，易受冷害影響產(chǎn)量與品質(zhì)。植物耐冷性涉及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累、抗氧化系統(tǒng)激活及激素信號調(diào)控，其中可溶性糖（如蔗糖、果糖）通過維持滲透平衡與能量供應(yīng)發(fā)揮核心作用。乙烯信號通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL家族和AP2/ERF家族成員（如ERF057）可協(xié)同調(diào)控逆境應(yīng)答基因，但其在葡萄耐冷中的分子網(wǎng)絡(luò)尚不明確。
技術(shù)路線
葡萄作為低溫敏感型經(jīng)濟(jì)作物，易受冷害影響產(chǎn)量與品質(zhì)。植物耐冷性涉及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累、抗氧化系統(tǒng)激活及激素信號調(diào)控，其中可溶性糖（如蔗糖、果糖）通過維持滲透平衡與能量供應(yīng)發(fā)揮核心作用。乙烯信號通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子EIN3/EIL家族和AP2/ERF家族成員（如ERF057）可協(xié)同調(diào)控逆境應(yīng)答基因，但其在葡萄耐冷中的分子網(wǎng)絡(luò)尚不明確。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
本研究首先解析了葡萄轉(zhuǎn)錄因子VaERF057在冷脅迫響應(yīng)中的功能。通過亞細(xì)胞定位證實(shí)VaERF057定位于細(xì)胞核，且其N端結(jié)構(gòu)域（1-132氨基酸）具有轉(zhuǎn)錄激活活性。啟動子-GUS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低溫處理顯著增強(qiáng)VaERF057啟動子活性，驗(yàn)證了其冷誘導(dǎo)特性。同時(shí)，檢測轉(zhuǎn)基因材料抗寒性指標(biāo)，結(jié)果表明VaERF057過表達(dá)抗寒性顯著提升。以上結(jié)果表明，VaERF057在葡萄冷脅迫下的具有積極作用。
本研究首先解析了葡萄轉(zhuǎn)錄因子VaERF057在冷脅迫響應(yīng)中的功能。通過亞細(xì)胞定位證實(shí)VaERF057定位于細(xì)胞核，且其N端結(jié)構(gòu)域（1-132氨基酸）具有轉(zhuǎn)錄激活活性。啟動子-GUS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低溫處理顯著增強(qiáng)VaERF057啟動子活性，驗(yàn)證了其冷誘導(dǎo)特性。同時(shí)，檢測轉(zhuǎn)基因材料抗寒性指標(biāo)，結(jié)果表明VaERF057過表達(dá)抗寒性顯著提升。以上結(jié)果表明，VaERF057在葡萄冷脅迫下的具有積極作用。
圖1. VaERF057是一種在細(xì)胞核中定位的冷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
圖2. VaERF057在葡萄冷脅迫反應(yīng)中的作用。
圖3. 通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）沉默VaERF057降低了葡萄葉的耐寒性。
為了探索VaERF057參與葡萄冷應(yīng)激反應(yīng)的潛在機(jī)制，通過聯(lián)合分析DAP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，在VaFBA1的啟動子中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與VaERF057結(jié)合的順式元件GCCCAC，并通過Y1H、EMSA和LUC驗(yàn)證了VaERF057與GCCCAC元件的相互作用。結(jié)果表明，VaERF057通過與GCCCAC元件的相互作用激活VaFBA1的表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證了VaFBA1基因功能，比較了冷處理?xiàng)l件下基因的表達(dá)水平，同時(shí)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因材料檢測耐寒性和糖代謝指標(biāo)，結(jié)果表明，VaFBA1通過調(diào)節(jié)糖代謝在冷應(yīng)激中發(fā)揮積極作用。
圖4. VaERF057的順式元件及其下游基因的鑒定。
圖5. VaERF057通過調(diào)節(jié)VaFBA1參與糖代謝。
圖6. VaFBA1在葡萄冷應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
圖7. 沉默VaFBA1可提高V. amurensis的冷敏感性。
圖5. VaERF057通過調(diào)節(jié)VaFBA1參與糖代謝。
圖6. VaFBA1在葡萄冷應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
圖7. 沉默VaFBA1可提高V. amurensis的冷敏感性。
進(jìn)一步篩選了乙烯信號相關(guān)基因，通過外源乙烯（ACC）和乙烯抑制劑（AVG）處理，結(jié)合RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)一種冷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子VaEIN3.1可以與VaERF057的啟動子結(jié)合，并通過Y1H、EMSA和LUC驗(yàn)證了VaEIN3.1可以結(jié)合到VaERF057的啟動子并激活其表達(dá)。同時(shí)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因材料，檢測抗寒和糖代謝指標(biāo)，結(jié)果表明VaEIN3.1在葡萄冷脅迫反應(yīng)中的積極作用且當(dāng)在葡萄葉片中敲低VaEIN3.1的表達(dá)時(shí)，VaERF057和VaFBA1的表達(dá)水平及糖含量均較低。以上結(jié)果支持了VaEIN3.1-VaERF057-VaFBA1模塊通過調(diào)節(jié)可溶性糖含量來提高葡萄耐寒性的積極作用。
圖8. VaEIN3.1與VaERF057啟動子結(jié)合，正向調(diào)節(jié)其表達(dá)。
圖9. VaEIN3.1通過調(diào)節(jié)VaERF057和VaFBA1參與糖代謝。
圖9. VaEIN3.1通過調(diào)節(jié)VaERF057和VaFBA1參與糖代謝。
本研究發(fā)現(xiàn)，VaEIN3.1-VaERF057-VaFBA1模塊通過級聯(lián)調(diào)控增強(qiáng)耐冷性：VaEIN3.1激活下游VaERF057表達(dá)，后者直接結(jié)合糖代謝關(guān)鍵酶基因VaFBA1啟動子，促進(jìn)可溶性糖合成與積累，從而提升細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)能力。該研究首次揭示乙烯信號與糖代謝通路協(xié)同抗冷的分子機(jī)制，為葡萄抗逆育種提供新靶點(diǎn)（如VaERF057和VaFBA1），并拓展了多基因模塊設(shè)計(jì)育種的策略，對改良其他作物的耐冷性具有參考價(jià)值。
圖10. VaEIN3.1-VaERF057-VaFBA1模塊調(diào)節(jié)葡萄在冷脅迫下的可溶性糖含量。
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