最近經常有同學和小尚反映細胞復蘇不起來，復蘇是細胞培養的一個常規操作，但其中有諸多細節容易被忽視，復蘇成敗和凍存、復蘇操作都密切相關，稍不注意就可能一失足成千古恨。

本篇主要從凍存角度進行分析，下周將更新復蘇操作的原因排查，歡迎同學們收藏追更~

我們先復習一下凍存步驟：

1. 提前準備好凍存液備用；

2. 離心獲得細胞沉淀后，加凍存液輕輕重懸細胞；

3. 將細胞懸液轉移入凍存管；

4. 如果使用程序凍存液，將凍存管放進程序凍存盒，放入-80℃冰箱過夜后液氮保存。如果使用非程序凍存液，則無需凍存盒。

▶凍存常見的錯誤操作

1. 使用常規含血清凍存液（培養基+血清+DMSO）時，沒有使用程序降溫凍存盒或泡沫盒等保溫措施。

降溫過快形成冰晶將導致細胞破裂死亡，常規含血清凍存液需要搭配凍存盒使用。現在市售的程序凍存盒可以確保溫度以1℃/min的速度緩慢下降。

沒有凍存盒的同學可以將凍存管放在泡沫盒中4℃靜置5-10min，再-20℃靜置2h后轉入-80℃過夜，第二天轉入液氮保存。

沒有凍存盒也沒有泡沫盒的同學，建議用無血清非程序凍存液。非程序凍存液含有更多的保護劑，可以直接重懸細胞后置于-80℃冰箱過夜后轉入液氮。

2. 凍存前細胞狀態不好或凍存密度太低。

細胞狀態良好是復蘇成功前提，我們選擇對數生長期、匯合度80%以上的細胞進行凍存。如果凍存前細胞培養上清呈橘黃色，建議換液后靜置培養4h再凍存。

雖然凍存液含有保護劑，但冷凍過程中仍會有少量細胞死亡。因此凍存的密度不能太低，以200-300萬/mL/管為宜。如果不方便計數，可以按一個T25瓶凍存1-2管，一個10cm皿凍存2-3管（注意細胞是80%以上匯合度）。

3. 直接將DMSO加入細胞懸液而沒有提前配制凍存液

DMSO被稀釋時會放熱（好奇的同學下次配凍存液可以摸一下，小編也是偶然摸了才發現的），會對較脆弱的細胞造成損傷。好養的細胞也許沒有很大影響，但為了課題順利，咱還是不能偷懶哈~先配好凍存液，再去處理細胞。

4. 凍存液重懸細胞后直接放進液氮，沒有經過-80℃冰箱

液氮的溫度是-196℃，未經梯度降溫的細胞直接放進液氮，毫無疑問細胞會死亡。將細胞放液氮罐口降溫也不行哈。

5. 凍存液配方不合適

研究表明5%-10%的DMSO最適合細胞凍存，具體比例要根據細胞種類調整，對DMSO敏感的細胞則需要降低比例。根據小尚的經驗，8% DMSO適用于大部分細胞系。

同時，還需根據細胞培養難度調整血清比例，越難養的細胞越要多加血清，過于脆弱的細胞可用血清+DMSO凍存，不加培養基。

無論用何種凍存液，都建議做凍檢再正式凍存：即凍存24h后復蘇一支，確認細胞狀態沒問題，即可進行大批量凍存。凍檢成功前要留至少一瓶細胞培養，以免復蘇失敗導致細胞絕種。

6. 凍存條件不當或凍存時間太久

通常，液氮儲存的時限和穩定性比-80℃冰箱要好很多。-80℃冰箱由于經常會開關門，溫度不夠穩定，導致細胞活率下降比較快，因此細胞盡量液氮保存。

沒有液氮罐的同學，把凍存管放在-80℃冰箱靠里面的位置，定期復蘇檢測活性。

未完待續......