鐵，是維持人體正常生理功能所必需的微量金屬營養(yǎng)元素。例如，在氧氣運輸、呼吸鏈電子傳遞、氧化還原平衡、大分子生物合成等方面，鐵起到至關(guān)重要的作用。鐵代謝失衡會引發(fā)多種免疫相關(guān)疾病，例如：鐵缺失會導(dǎo)致B細胞細胞周期停滯并引發(fā)B細胞譜系發(fā)育受阻；鐵超載則會促進CD4+T細胞病理性擴增，引發(fā)紅斑狼瘡的自身免疫表型。癌癥本身也是異常增殖細胞逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視，免受免疫細胞殺傷和清除的綜合性疾病。然而，鐵元素，特別是鐵代謝，在癌癥發(fā)生和惡性進展中起到何種作用，在腫瘤微環(huán)境中如何調(diào)控抗腫瘤免疫，這些科學(xué)問題仍然知之甚少。

最近，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院朱鶴研究員團隊，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌微環(huán)境中存在一群鐵富集的癌相關(guān)成纖維細胞，根據(jù)英文縮寫(Ferrum iron CAFs)作者將其命名為FerroCAF。FerroCAF在PCa中的比例隨疾病進展而升高，并通過鐵依賴的表觀遺傳學(xué)機制，促進PCa腫瘤免疫抑制。該項研究是繼成肌纖維型CAF（myCAF）、免疫調(diào)節(jié)型CAF（iCAF）、抗原遞呈型CAF（apCAF）、衰老型CAF（senCAF）等相繼被報道后，我國學(xué)者揭示的促癌CAF新亞型：FerroCAF。
 

《Nature Communications》

研究材料和方法
作者利用單細胞測序技術(shù)（scRNA-seq）、多種前列腺癌(prostate cancer, PCa)轉(zhuǎn)基因小鼠模型、前列腺癌臨床組織樣本，普魯士藍鐵染色、連續(xù)切片免疫組化和免疫熒光染色、Ferro-Orange胞內(nèi)鐵探針流式檢測技術(shù)，揭示了鐵富集的CAF在包括前列腺癌、肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中普遍存在。值得一提的是：作者在驗證FerroCAF通過分泌髓系細胞相關(guān)分泌蛋白（myeloid cell associated secretory protein, MASP）如CXCL1, CCL2, CSF1等募集髓系來源抑制性細胞MDSC、腫瘤相關(guān)巨噬細胞TAM等，促進腫瘤免疫抑制的研究中，使用了賽業(yè)生物（Cyagen）的C-NKG免疫缺陷型小鼠，并闡明了FerroCAFs發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)依賴于免疫細胞的功能。

技術(shù)路線

實驗結(jié)果
1. 新型鐵富集CAF在前列腺癌中隨疾病進展而富集

圖1 新型鐵富集CAF在前列腺癌中隨疾病進展而富集

作者利用scRNA-seq技術(shù)對感興趣的CAF組分進行聚類，發(fā)現(xiàn)Cluster-1是唯一一群既隨著腫瘤進展（從3月到12月）比例上升，且在兩個時間點，占CAF中比例最高的亞群。KEGG分析揭示，Cluster-1有“元素吸收”和“鐵死亡”兩個關(guān)鍵特征。由于Cluster-1比例隨著腫瘤生長而升高，并未發(fā)生鐵死亡，作者進而從鐵代謝的方向入手，通過普魯士藍鐵染色實驗，揭示了在腫瘤組織的基質(zhì)區(qū)域存在一群鐵富集的stromal cell。在補充數(shù)據(jù)中，作者利用連續(xù)組織切片，發(fā)現(xiàn)這群鐵富集的stromal cell表達CAF標志物：PDPN，αSMA，PDGFR，S100A4，Vimentin等，同時不表達上皮Cd326/EpCam，不表達內(nèi)皮Cd31，不表達免疫Cd45等譜系標記物，因此作者將其命名為鐵富集的癌相關(guān)成纖維細胞FerroCAF。

2. FerroCAF的特異性標記物為Pvr，且分泌MASP細胞因子和炎性因子

 
圖2 FerroCAF的特異性標記物為Pvr，且分泌MASP細胞因子和炎性因子

作者利用scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)Cluster-1 FerroCAF特異性高表Pvr (poliovirus receptor), 進而用免疫熒光染色等方法驗證了Pvr是FerroCAF可靠的特異性細胞表面標記物，并且在小鼠和人類前列腺癌FerroCAF中具有種屬保守型。在FerroCAF排名靠前的差異表達基因中，絕大部分是髓系來源抑制性細胞（Myeloid Derived Suppressor Cell, MDSC）和腫瘤相關(guān)巨噬細胞（Tumor Associated Macrophage, TAM）相關(guān)的細胞因子和炎性因子，作者將其定義為MASP，包括CSF1，CCL2，CCL7，CXCL1，CXCL2等。這提示FerroCAFs可能通過MASP招募MDSC和TAM在腫瘤微環(huán)境中大量聚集。作者利用CellChat分析、條件性培養(yǎng)基刺激等實驗闡明FerroCAFs和MDSC存在很強的“細胞-細胞通訊”活性，促進髓系細胞高表達Arg1, Il10，Tgfb等免疫抑制性因子。

3. FerroCAF鐵富集是由Hmox1高表達催化Heme降解釋放游離鐵導(dǎo)致

 
圖3 FerroCAF鐵富集是由Hmox1高表達催化Heme降解釋放游離鐵導(dǎo)致

作者進而探究了導(dǎo)致FerroCAF鐵富集表型的產(chǎn)生機制，研究者發(fā)現(xiàn)FerroCAF和其他CAF亞型相比，鐵攝取、鐵外排、鐵儲存等相關(guān)基因均無顯著差異。有趣的是，和鐵代謝密切相關(guān)的血紅素加氧酶Hmox1在FerroCAF中高表達，Hmox1的經(jīng)典生物學(xué)功能在于催化Heme降解，并釋放游離鐵Fe2+導(dǎo)致鐵富集。作者為了驗證該假說，利用Hmox1抑制劑（Zn-PP, iHmox1）和Hmox1敲低等方法，發(fā)現(xiàn)抑制或下調(diào)Hmox1之后，F(xiàn)erroCAF中鐵含量顯著下降，并且MASP的轉(zhuǎn)錄表達也受到顯著抑制。

4. Hmox1抑制劑能顯著抑制MDSC和TAM募集，并促進T細胞浸潤和抗腫瘤免疫
 

 
圖4 Hmox1抑制劑顯著抑制MDSC和TAM募集，并促進T細胞浸潤

作者接著利用同種移植實驗將FerroCAF和小鼠PCa細胞混合后，使用了C-NKG免疫缺陷型小鼠（由賽業(yè)生物提供）對C57BL/6小鼠（雄性）進行前列腺原位同種移植實驗。隨機分組后，一組用Hmox1抑制劑Zn-PP（iHmox1）進行給藥，另一組則用vehicle作為對照處理。作者在實驗終點比較了上述兩組小鼠的腫瘤大小、質(zhì)量、增殖等指標，發(fā)現(xiàn)Hmox1抑制劑能顯著抑制原位前列腺癌腫瘤生長。作者進而利用流式細胞術(shù)分析了腫瘤內(nèi)MDSC、TAM、T細胞等浸潤情況。盡管Hmox1抑制劑并未影響總體免疫細胞浸潤，但深刻改變了瘤內(nèi)免疫細胞的組分：MDSC（包括PMN-MDSC和M-MDSC）和促癌型M2-TAM的數(shù)量均顯著下調(diào)；而抑癌型M1-TAM和Cd8+ T細胞的數(shù)量則顯著增加。Hmox1抑制劑也促進了T細胞殺傷性相關(guān)基因如Gzmb、Ifng等表達。

5. FerroCAF中鐵富集激活Kdm6b介導(dǎo)的表觀遺傳重編程啟動MASP轉(zhuǎn)錄
 

 
圖5 FerroCAF鐵富集激活Kdm6b介導(dǎo)的表觀遺傳重編程啟動MASP轉(zhuǎn)錄表達

作者進而探索鐵富集的表型如何介導(dǎo)MASP的表達。由于CAF和cancer cell相比，其genetic層面的突變相對較少，其促癌功能的獲得更多是由于epigenetic層面改變導(dǎo)致。基于此，作者設(shè)想鐵富集可能激活了鐵依賴的表觀遺傳學(xué)酶功能。為了驗證該假說，作者檢測FerroCAF中高表達的鐵依賴的表觀遺傳因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組蛋白去甲基化酶Kdm6b（催化H3K27me3去甲基化修飾）在FerroCAFs中顯著性上調(diào)。生化實驗驗證了Kdm6b在FerroCAF中表達上調(diào)，以及H3K27me3修飾在FerroCAFs中水平下調(diào)。作者還利用CUT&Tag實驗揭示，在Hmox1敲除后(Hmox1-KO)的FerroCAF中，和對照相比，anti-H3K27me3 antibody和DNA結(jié)合明顯增強，在MASP相關(guān)的gene locus，H3K27me3的mark也顯著上調(diào)。這提示：從Hmox1/iron/Kdm6b信號軸上游敲除Hmox1，能誘發(fā)下游Kdm6b活性被抑制，導(dǎo)致MASP基因在內(nèi)的全基因組H3K27me3修飾增強，導(dǎo)致MASP相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄抑制。

6. FerroCAF在前列腺癌中富集程度預(yù)示較差的臨床預(yù)后

 
圖6 FerroCAF在前列腺腫瘤中的富集程度預(yù)示著較差的臨床預(yù)后

最后作者利用已發(fā)表的臨床PCa的單細胞測序數(shù)據(jù)、TCGA數(shù)據(jù)等，將FerroCAF的特征性基因（signature genes）：HMOX1、KDM6B、PVR、IL6、CCL2、CSF1、CXCL1等合并為一個基因集，命名為FerroScore用來反映FerroCAF的富集程度。結(jié)果顯示：作者不僅在其他發(fā)表的scRNA-seq數(shù)據(jù)中找到了FerroCAF亞型的存在，也通過生信分析等手段揭示了FerroCAF的富集預(yù)示較高的免疫抑制性特征和較短的患者生存期。研究人員還檢測了FerroCAF在其他類型癌癥中的存在和臨床相關(guān)性。令人意外的是，作者通過增強型普魯士藍鐵染色、生信分析等方法，揭示FerroCAF在臨床肺癌樣本、卵巢癌樣本中均存在HMOX1高表達、鐵富集的FerroCAF。和前列腺癌類似，肺癌、卵巢癌中FerroCAF的富集程度中也預(yù)示著較高的免疫抑制性特征和較短的生存期。這提示FerroCAF在多種人類惡性腫瘤中廣泛存在，也預(yù)示通過阻斷Hmox1/iron/Kdm6b信號，抑制FerroCAF活性，能激活抗腫瘤免疫活性的廣譜可適性。

圖7 阻斷Hmox1/iron/Kdm6b信號，抑制FerroCAF活性，進而激活抗腫瘤免疫在多種癌癥中具有廣譜可適性

實驗結(jié)論
作者在前列腺癌微環(huán)境中揭示了一群未被報道的“鐵富集的癌相關(guān)成纖維細胞（FerroCAF）”，利用生信分析、生化、細胞和動物實驗闡明了FerroCAF中鐵富集表型是由血紅素加氧酶Heme Oxygenase 1 (Hmox1)高表達、催化血紅素heme降解導(dǎo)致游離鐵釋放導(dǎo)致；鐵聚集進而激活鐵依賴的組蛋白去甲基化酶Kdm6b，后者促進髓系細胞相關(guān)分泌蛋白（myeloid cell associated secretory protein, MASP）如CXCL1, CCL2, CSF1等轉(zhuǎn)錄表達，募集髓系來源抑制性細胞MDSC、腫瘤相關(guān)巨噬細胞TAM等，促進前列腺癌腫瘤免疫抑制。作者明確了Hmox1/iron/Kdm6b信號軸在維持FerroCAF細胞鐵富集表型、促腫瘤免疫抑制活性方面的關(guān)鍵作用。基于此，作者提出：通過抑制劑干預(yù)Hmox1/iron/Kdm6b信號軸，能有效抑制FerroCAF活性、促進Cd8+T細胞浸潤、激活抗腫瘤免疫活性的治療策略。作者還在其他癌癥類型，例如小細胞肺癌、肺腺癌、惡性卵巢癌臨床組織樣本中也證實了FerroCAF跨癌種存在，也提示阻斷FerroCAF免疫抑制活性，激活以前列腺癌為代表的“冷腫瘤”的抗腫瘤免疫活性，具有廣譜可適性。