具有致病性線粒體DNA (mtDNA)點突變的患者通常會出現致殘性神經系統綜合征，導致嚴重殘疾和過早死亡[1]。至少有1/5000的人口受到mtDNA疾病的影響[2]。線粒體遺傳疾病的單核苷酸多態性(SNP)通常存在異質性[3]，即：野生型和突變型共存。突變異質率不同的個體表現出不一樣的臨床癥狀[1]。同質的mtDNA突變可以很容易地在血液中檢測到。然而，對于異質突變，突變mtDNA的百分比水平因組織而異，并且在同一個體中也可能隨時間而變化(例如，導致Leber遺傳性視神經病變(LHON)的m.11778A>G)。因此SNP異質率的精確檢測對線粒體遺傳疾病的診斷至關重要。最近，基于CRISPR的分子診斷技術因其特異性強、靈敏度高、檢測速度快等優點受到廣泛關注[4, 5]。例如，巢式RPA和CRISPR/Cas12a輔助病毒鑒定的多重分析平臺(MAPnavi)被用于快速(< 40分鐘)診斷多種呼吸道病毒[6]。然而，這些單信號輸出方法難以準確診斷mtDNA疾病的異質性水平，因為結果受到樣本中模板總量的影響。與基因組SNP基因分型不同，mtDNA疾病的異質性水平診斷需要更準確的SNP豐度定量，這仍然是一個挑戰。

化學與環境工程學院劉翼振副教授團隊在生物傳感器頂級期刊《Biosensors and Bioelectronics》上發表了題為“RatioCRISPR: A Ratiometric Biochip Based on CRISPR/Cas12a for Automated and Multiplexed Detection of Heteroplasmic SNPs in Mitochondrial DNA”的研究，2022級化學專業碩士研究生吳小龍為第一作者，陳勇副研究員和劉翼振副教授為共同通訊作者，深圳大學為唯一通訊單位。
Link:https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115676

該研究提出了一種自動化的CRISPR/Cas12a比例型生物芯片傳感器(RatioCRISPR)，用于準確量化線粒體疾病SNP的異質性水平：首先，從mtDNA疾病患者的血液樣本中提取DNA。然后與RPA擴增試劑混合，從樣品孔中加入到芯片。之后，芯片將按照預設程序自動運行(圖1a)。而后，采用比率信號輸出的方法，提高了穩定性，最大限度地減少了樣品濃度對異質性水平檢測的影響，使診斷結果只與模板中野生型和突變型的相對含量有關。最終RatioCRISPR實現了在25分鐘內同時準確地檢測8個樣品，檢出限(LOD)為15.7 aM。并成功檢測了3種mtDNA點突變(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的13個模擬樣本，這些突變導致Leber遺傳性視神經病變(LHON)[8]，并設定了異質性閾值(60%)來評估疾病風險。這種自動化、精確的生物傳感器在診斷多個SNP，特別是具有異質性的SNP具有廣泛的應用，為遺傳咨詢、流行病學研究和多種異質SNP疾病提供了一個快速、經濟、實時的臨床診斷平臺。
  作者提出了一種通用的、自動化的RPA-CRISPR/Cas12a比率測定芯片(RatioCRISPR)，用于mtDNA疾病的診斷。作者首次嘗試在基于CRISPR/Cas的生物芯片中引入比值信號輸出方法，實現SNP相對豐度的精確定量。該平臺具有以下優點:1）建立比率型信號輸出系統來量化異質性水平，使樣品濃度的影響減小。2）集成式封閉芯片設計，避免氣溶膠污染，實現多路自動化檢測。這種先進、便捷的生物傳感器具有通用性、自動化程度高、準確度高等特點，在診斷多個SNP，特別是具有異質性變異的SNP方面具有良好的實用性和市場應用前景。

RPA試劑盒及試紙條系列：

貨號	產品	規格
JY0209	雙靶標HybriDetect側向層析試紙條（彩虹型）	50T
JY0201	單靶標HybriDetect側向層析試紙條（彩虹型）	50T
JY0307	Tiosbio® CRISPR單酶切及擴增產物檢測試紙條	50T
JY0301	CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條	50T
JY0308	Tiosbio® CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍）	50T
WLB8201KIT	DNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型）	48T
WLE8202KIT	DNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）	48T
WLN8203KIT	DNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）	48T
WLRB8204KIT	RNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型）	48T
WLRE8205KIT	RNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）	48T
WLRN8206KIT	RNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）	48T
WLB5001	DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體基礎型）	100T
WLN5002	DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體膠體金型）	100T
WLR5003	DNA恒溫快速擴增試劑盒（液體熒光型）	100T
WLRB5001	RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體基礎型）	100T
WLRN5002	RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體膠體金型）	100T
WLRE5003	RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體熒光型）	100T

Cas酶系列

貨號	包裝規格	中文名稱
32108-01	100 pmoL	LbCas12a (Cpf1)
32108-03	1,000 pmoL	LbCas12a (Cpf1)
32117-01	100 pmoL	LwaCas13a (C2c2)
32117-03	1,000 pmoL	LwaCas13a (C2c2)
32118-01	100 pmoL	AapCas12b (C2c1)
32118-03	1,000 pmoL	AapCas12b (C2c1)
32119-01	100 pmoL	Un1Cas12f1 (Cas14a1)
32119-03	1,000 pmoL	Un1Cas12f1 (Cas14a1)
32104-01	100 pmoL	AsCas12a (Cpf1)
32104-03	1,000 pmoL	AsCas12a (Cpf1)
32116-01	100 pmoL	AacCas12b (C2c1)
32116-03	1,000 pmoL	AacCas12b (C2c1)
32106-01	100 pmoL	FnCas12a (Cpf1)
32106-03	1,000 pmoL	FnCas12a (Cpf1)
32110-01	100 pmoL	Lb5Cas12a (Cpf1)
32110-03	1,000 pmoL	Lb5Cas12a (Cpf1)
32101-01	100 pmoL	SpCas9
32101-03	1,000 pmoL	SpCas9
32102-01	100 pmoL	Sp-dCas9
32102-03	1,000 pmoL	Sp-dCas9
32120-01	100 pmoL	Sp-nCas9（H840A）
32120-03	1,000 pmoL	Sp-nCas9（H840A）