文獻解讀：人類精子發生過程中的全基因組DNA甲基化水平變化
精子發生和精子功能需要在生殖細胞系中正確建立DNA甲基化模式。
德國明斯特大學生殖與再生生物學研究所生殖醫學中心Sandra Laurentino團隊分析了人類精子發生（spermatogenesis）過程中的全基因組DNA甲基化變化以及在精子發生障礙時的變化。分析結果表明精子發生與甲基化重塑有關，包括初級精母細胞中DNA甲基化的整體下降，然后選擇性再甲基化，最終形成精子細胞/精子特異性甲基化組。精子細胞/精子中的低甲基化區域在 DMRT 和 SOX 家族成員以及精子細胞特異性基因的特異性轉錄因子結合位點中富集。雖然SINEs（短散在元件）在精子發生過程中表現出不同的甲基化模式，但LINEs（長散在元件）的DNA甲基化未發生變化。在精子發生障礙中，生殖細胞表現出相當大的DNA甲基化變化，這些變化在參與精子發生的轉座元件和基因中顯著富集。且在精子發生障礙中檢測到SVA和L1HS的低甲基化，表明這些區域的異常編程與生殖細胞減數分裂后進展的失敗有關。
相關研究成果于2024年5月11日以“Genome-wide DNA methylation changes in human spermatogenesis”為題發表在《The American Journal of Human Genetics》（IF 9.8 / 1區）期刊上。
Introduction
越來越多證據表明，雄性生殖細胞甲基化模式建立不僅僅局限于胚胎發育階段，在成年期精子發生過程中繼續存在。特別是在減數分裂的早期階段，當復制和重組發生時，基因組會發生低甲基化。這一事件在小鼠和人類之間高度保守，并被假設是DNA甲基化維持延遲的結果。盡管如此，關于人類精子發生過程中的DNA甲基化水平變化是否會影響精子發生和精子功能，目前了解的信息還有限。
表觀遺傳重塑，包括甲基化重編程，在哺乳動物的細胞命運決定中至關重要。最近已經證明，參與DNA甲基化機制的酶功能受損會導致精子發生過程中的一系列干擾，包括完全不育。在大多數嚴重男性不育病例中，精子產量大幅減少，病因不明。隱匿精子癥（cryptozoospermia，CZ）特征是經歷減數分裂的生殖細胞急劇減少，以及最未分化的精原細胞積累。此前研究報告了CZ男性的大量生殖細胞中存在DNA甲基化異常，因此假設DNA甲基化異常可能是潛在原因。然而不同類型的生殖細胞攜帶DNA甲基化變化程度、受影響的基因組區域、以及它們在減數分裂后生殖細胞減少中的參與程度仍有待評估。
尤其在減數分裂過程中，基因組在很大程度上依賴于轉座元件（TEs）抑制，且通常通過表觀遺傳機制實現，如基因沉默組蛋白修飾、piwi互作RNA（piRNA）機制和DNA甲基化。因此抑制如LINE/SINE這樣的TEs，對于維持生殖細胞基因組的完整性至關重要，當缺失時可能會導致小鼠不育。轉座元件的甲基化差異或TEs沉默通路的功能障礙與男性不育相關。DNA甲基化在精子發生過程中對不同TEs的保護作用及其與男性不育的關系，特別是在減數分裂的低甲基化時期，仍有待闡明。
通過對人類男性生殖細胞亞群進行全甲基化分析表明人類精子發生與甲基化的表觀遺傳重塑有關。初級精母細胞中DNA甲基化整體下降后，精子細胞/精子中特定區域的選擇性再甲基化，表明低甲基化的初級精母細胞基因組不僅僅是DNA復制的暫時副作用，而是建立精子細胞/精子特異性甲基化所必需。研究在男性不育生殖細胞中檢測到DNA甲基化的顯著差異，尤其在基因間區域和TEs中，并證實了不同TEs在精子發生過程中被差異性地重編程。本研究增加了當前對人類精子發生過程中DNA甲基化變化作用的證據，并指出DNA甲基化變化和精子發生失敗（生精失敗）之間的關聯。
結果圖形
（1）初級精母細胞表現出全基因組DNA甲基化水平降低
圖1：初級精母細胞表現出全基因組DNA甲基化水平降低
（A） 從精子發生正常樣本的生殖細胞中檢索全基因組甲基組數據示意圖（對照，CTR）。CpG是指通過酶促甲基測序（EM-seq）在所有生殖細胞組分中捕獲的平均CpG數（n=12）。
（B） 線圖描繪了與公布的血液和精子樣本相比，每個CTR樣本和生殖細胞類型的50個印跡對照區（ICR）中的甲基化。
（C） 方框圖顯示平均全基因組DNA甲基化水平。統計檢驗：ANOVA檢驗，然后是Tukey-HSD檢驗：與所有其他生殖細胞相比，***4C <0.001。數據表示為中位數（中心線）、上/下四分位數（框限）、1.5×四分位數間距（須）。
（D） 線圖顯示在轉錄起始位點（TSS）和轉錄終止位點（TES）上游和下游50個區間（bin）和5kb的genebody中每組的平均甲基化水平。
（E） 小提琴圖代表不同基因組區室中甲基化CpG。Undiff：未分化的精原細胞；Diff：精原細胞分化；4C：初級精母細胞；1C，精子細胞/精子。
（2）精子發生過程中的DMR在SINE重復序列中富集
圖2：精子發生過程中DMRs在SINE重復序列中的富集情況。
A. 熱圖顯示所有生殖細胞類型比較的差異甲基化區域（DMRs）的甲基化值和CpG位點數量。
B. DMRs與基因和啟動子相關。
C. 不同組比較中每個DMR的CpG數量頻率。
D. 小提琴圖描述每個組比較中DMR寬度分布。
E. 不同組比較中DMRs的重疊（100%）。獨有DMRs由點表示，重疊DMRs通過連接節點顯示。
F. 每條染色體上的DMRs分布，按染色體大小（bp）縮放，并在一組內按其總數歸一化。
G. 對一般基因組特征和基因組重復序列的DMRs進行富集。
（3）精子細胞/精子中的低甲基化區域在TF結合位點富集
圖3：精子細胞/精子中的低甲基化區域在特定的TF結合位點富集
A. 描述了HOMER鑒定的已知motif的富集序列。對所有DMR比較進行HOMER分析，并顯示顯著結果（p<0.01，FDR<0.05）。
B. 點圖顯示在用HOMER鑒定的DMR中具有富集motif的前三個轉錄因子（TF）的平均單細胞表達16。SPC，精母細胞；SPD，精子細胞。
（4）DMR相關基因的生殖細胞類型特異性表達
圖4：精子/精子細胞甲基化組中的低甲基化區域標記精子細胞的特異性基因。
A. 低甲基化差異甲基化區域（DMR）相關基因的單細胞表達情況，這些基因在精子細胞中有特異性表達，以及高甲基化DMR相關基因在未分化精原細胞中的特異性表達。表明在未分化精原細胞與1C（精子/精子細胞）DMRs之間存在差異。
B. AGPAT3位點DMR甲基化示例，該位點在未分化（Undiff）和分化（Diff）精原細胞中呈現高甲基化，在4C（初級精母細胞）和1C（精子/精子細胞）中呈現低甲基化，并且在精子細胞（SPD）中特異性表達。此外，還展示了人類精子中H3K36me3組蛋白修飾數據（GSE40195）。
Undiff：未分化精原細胞；Diff：分化精原細胞；4C：初級精母細胞；1C：精子/精子細胞；SPC：精母細胞；SPD：精子細胞
（5）精子發生障礙時轉座元件（TEs）和精子發生基因的甲基化變化
圖5：精子發生障礙時轉座元件（TEs）和精子發生基因的甲基化變化。
A. 從精子發生障礙（CZ，隱匿精子癥）樣本中檢索生殖細胞的全基因組甲基組數據示意圖。
B. 對照組（CTR）和隱匿精子癥患者（CZ）中不同細胞類型比例箱形圖。
C. 對照組和隱匿精子癥患者相同細胞類型（Undiff vs. Undiff； Diff vs. Diff；4C vs. 4C）的差異甲基化區域（DMRs）的甲基化值熱圖。
D. CTR/CZ DMRs在染色體上的分布，按染色體大小（bp）縮放，并在一組內按其總數歸一化。
E. CTR/CZ DMRs在功能通用基因組區域和基因組重復序列中的富集情況。
F. 對照組和隱匿精子癥患者生殖細胞中進化上較年輕的（白色框：L1Hs、L1PA2-5和SVA_D/F）和較老的（灰色框：HERVH-int和L1M7）轉座元件（TEs）的CpG甲基化小提琴圖。
CTR：對照組；CZ：隱匿精子癥患者；Undiff：未分化精原細胞；Diff：分化精原細胞；4C：初級精母細胞；1C：精子/精子細胞
參考文獻： Siebert-Kuss et al., Genome-wide DNA methylation changes in human spermatogenesis, The American Journal of Human Genetics (2024), https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2024.04.017.
德國明斯特大學生殖與再生生物學研究所生殖醫學中心Sandra Laurentino團隊分析了人類精子發生（spermatogenesis）過程中的全基因組DNA甲基化變化以及在精子發生障礙時的變化。分析結果表明精子發生與甲基化重塑有關，包括初級精母細胞中DNA甲基化的整體下降，然后選擇性再甲基化，最終形成精子細胞/精子特異性甲基化組。精子細胞/精子中的低甲基化區域在 DMRT 和 SOX 家族成員以及精子細胞特異性基因的特異性轉錄因子結合位點中富集。雖然SINEs（短散在元件）在精子發生過程中表現出不同的甲基化模式，但LINEs（長散在元件）的DNA甲基化未發生變化。在精子發生障礙中，生殖細胞表現出相當大的DNA甲基化變化，這些變化在參與精子發生的轉座元件和基因中顯著富集。且在精子發生障礙中檢測到SVA和L1HS的低甲基化，表明這些區域的異常編程與生殖細胞減數分裂后進展的失敗有關。
相關研究成果于2024年5月11日以“Genome-wide DNA methylation changes in human spermatogenesis”為題發表在《The American Journal of Human Genetics》（IF 9.8 / 1區）期刊上。
Introduction
越來越多證據表明，雄性生殖細胞甲基化模式建立不僅僅局限于胚胎發育階段，在成年期精子發生過程中繼續存在。特別是在減數分裂的早期階段，當復制和重組發生時，基因組會發生低甲基化。這一事件在小鼠和人類之間高度保守，并被假設是DNA甲基化維持延遲的結果。盡管如此，關于人類精子發生過程中的DNA甲基化水平變化是否會影響精子發生和精子功能，目前了解的信息還有限。
表觀遺傳重塑，包括甲基化重編程，在哺乳動物的細胞命運決定中至關重要。最近已經證明，參與DNA甲基化機制的酶功能受損會導致精子發生過程中的一系列干擾，包括完全不育。在大多數嚴重男性不育病例中，精子產量大幅減少，病因不明。隱匿精子癥（cryptozoospermia，CZ）特征是經歷減數分裂的生殖細胞急劇減少，以及最未分化的精原細胞積累。此前研究報告了CZ男性的大量生殖細胞中存在DNA甲基化異常，因此假設DNA甲基化異常可能是潛在原因。然而不同類型的生殖細胞攜帶DNA甲基化變化程度、受影響的基因組區域、以及它們在減數分裂后生殖細胞減少中的參與程度仍有待評估。
尤其在減數分裂過程中，基因組在很大程度上依賴于轉座元件（TEs）抑制，且通常通過表觀遺傳機制實現，如基因沉默組蛋白修飾、piwi互作RNA（piRNA）機制和DNA甲基化。因此抑制如LINE/SINE這樣的TEs，對于維持生殖細胞基因組的完整性至關重要，當缺失時可能會導致小鼠不育。轉座元件的甲基化差異或TEs沉默通路的功能障礙與男性不育相關。DNA甲基化在精子發生過程中對不同TEs的保護作用及其與男性不育的關系，特別是在減數分裂的低甲基化時期，仍有待闡明。
通過對人類男性生殖細胞亞群進行全甲基化分析表明人類精子發生與甲基化的表觀遺傳重塑有關。初級精母細胞中DNA甲基化整體下降后，精子細胞/精子中特定區域的選擇性再甲基化，表明低甲基化的初級精母細胞基因組不僅僅是DNA復制的暫時副作用，而是建立精子細胞/精子特異性甲基化所必需。研究在男性不育生殖細胞中檢測到DNA甲基化的顯著差異，尤其在基因間區域和TEs中，并證實了不同TEs在精子發生過程中被差異性地重編程。本研究增加了當前對人類精子發生過程中DNA甲基化變化作用的證據，并指出DNA甲基化變化和精子發生失敗（生精失敗）之間的關聯。
結果圖形
（1）初級精母細胞表現出全基因組DNA甲基化水平降低
圖1：初級精母細胞表現出全基因組DNA甲基化水平降低
（A） 從精子發生正常樣本的生殖細胞中檢索全基因組甲基組數據示意圖（對照，CTR）。CpG是指通過酶促甲基測序（EM-seq）在所有生殖細胞組分中捕獲的平均CpG數（n=12）。
（B） 線圖描繪了與公布的血液和精子樣本相比，每個CTR樣本和生殖細胞類型的50個印跡對照區（ICR）中的甲基化。
（C） 方框圖顯示平均全基因組DNA甲基化水平。統計檢驗：ANOVA檢驗，然后是Tukey-HSD檢驗：與所有其他生殖細胞相比，***4C <0.001。數據表示為中位數（中心線）、上/下四分位數（框限）、1.5×四分位數間距（須）。
（D） 線圖顯示在轉錄起始位點（TSS）和轉錄終止位點（TES）上游和下游50個區間（bin）和5kb的genebody中每組的平均甲基化水平。
（E） 小提琴圖代表不同基因組區室中甲基化CpG。Undiff：未分化的精原細胞；Diff：精原細胞分化；4C：初級精母細胞；1C，精子細胞/精子。
（2）精子發生過程中的DMR在SINE重復序列中富集
圖2：精子發生過程中DMRs在SINE重復序列中的富集情況。
A. 熱圖顯示所有生殖細胞類型比較的差異甲基化區域（DMRs）的甲基化值和CpG位點數量。
B. DMRs與基因和啟動子相關。
C. 不同組比較中每個DMR的CpG數量頻率。
D. 小提琴圖描述每個組比較中DMR寬度分布。
E. 不同組比較中DMRs的重疊（100%）。獨有DMRs由點表示，重疊DMRs通過連接節點顯示。
F. 每條染色體上的DMRs分布，按染色體大小（bp）縮放，并在一組內按其總數歸一化。
G. 對一般基因組特征和基因組重復序列的DMRs進行富集。
（3）精子細胞/精子中的低甲基化區域在TF結合位點富集
圖3：精子細胞/精子中的低甲基化區域在特定的TF結合位點富集
A. 描述了HOMER鑒定的已知motif的富集序列。對所有DMR比較進行HOMER分析，并顯示顯著結果（p<0.01，FDR<0.05）。
B. 點圖顯示在用HOMER鑒定的DMR中具有富集motif的前三個轉錄因子（TF）的平均單細胞表達16。SPC，精母細胞；SPD，精子細胞。
（4）DMR相關基因的生殖細胞類型特異性表達
圖4：精子/精子細胞甲基化組中的低甲基化區域標記精子細胞的特異性基因。
A. 低甲基化差異甲基化區域（DMR）相關基因的單細胞表達情況，這些基因在精子細胞中有特異性表達，以及高甲基化DMR相關基因在未分化精原細胞中的特異性表達。表明在未分化精原細胞與1C（精子/精子細胞）DMRs之間存在差異。
B. AGPAT3位點DMR甲基化示例，該位點在未分化（Undiff）和分化（Diff）精原細胞中呈現高甲基化，在4C（初級精母細胞）和1C（精子/精子細胞）中呈現低甲基化，并且在精子細胞（SPD）中特異性表達。此外，還展示了人類精子中H3K36me3組蛋白修飾數據（GSE40195）。
Undiff：未分化精原細胞；Diff：分化精原細胞；4C：初級精母細胞；1C：精子/精子細胞；SPC：精母細胞；SPD：精子細胞
（5）精子發生障礙時轉座元件（TEs）和精子發生基因的甲基化變化
圖5：精子發生障礙時轉座元件（TEs）和精子發生基因的甲基化變化。
A. 從精子發生障礙（CZ，隱匿精子癥）樣本中檢索生殖細胞的全基因組甲基組數據示意圖。
B. 對照組（CTR）和隱匿精子癥患者（CZ）中不同細胞類型比例箱形圖。
C. 對照組和隱匿精子癥患者相同細胞類型（Undiff vs. Undiff； Diff vs. Diff；4C vs. 4C）的差異甲基化區域（DMRs）的甲基化值熱圖。
D. CTR/CZ DMRs在染色體上的分布，按染色體大小（bp）縮放，并在一組內按其總數歸一化。
E. CTR/CZ DMRs在功能通用基因組區域和基因組重復序列中的富集情況。
F. 對照組和隱匿精子癥患者生殖細胞中進化上較年輕的（白色框：L1Hs、L1PA2-5和SVA_D/F）和較老的（灰色框：HERVH-int和L1M7）轉座元件（TEs）的CpG甲基化小提琴圖。
CTR：對照組；CZ：隱匿精子癥患者；Undiff：未分化精原細胞；Diff：分化精原細胞；4C：初級精母細胞；1C：精子/精子細胞
參考文獻： Siebert-Kuss et al., Genome-wide DNA methylation changes in human spermatogenesis, The American Journal of Human Genetics (2024), https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2024.04.017.
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