斑馬魚與小鼠一樣，是一種著名的動物模型，廣泛應用于表觀遺傳學、毒理學、臨床研究、神經(jīng)科學等生物學研究。這主要是因為斑馬魚的胚胎和幼體易于遺傳操作，而且它們體積小，光學清晰度高，易于用光學顯微鏡觀察。

圖1 利用斑馬魚在藥物篩選中觀察生物體表型^[1]

圖2 藥物篩選、自動成像以及斑馬魚幼體分析^[2] 

    Celloger^® Mini Plus提供了一個自動生成多層圖像的Z-stacking功能，Celloger^®分析軟件提供了一個合并功能，可以輕松地組合多層熒光圖像。這些功能使研究人員能夠在單個圖像中觀察三維(3D)結構。通過功能表達綠色熒光蛋白(GFP)觀察轉基因斑馬魚(幼魚)，詳見下面的步驟1和2。

圖3 Celloger^® Mini Plus設備圖
 

應用實例：

步驟1，Z-stacking

    如由細胞組成的組織，根據(jù)焦點可以提供各種信息，因此確定各種焦點是至關重要的。通過設置層與層之間的距離(“Step”)和拍攝的圖像數(shù)量(“N,N”)，使用Celloger®MiniPlus可以在設置位置(Z位置)的上方和下方以固定的間隔(“Step”)生成多層圖像(圖4)。每個觀察點可以輸入不同的設置，并且可以在不同的觀察點執(zhí)行不同的Z-stacking設置。

圖4 Z-stacking

    我們使用Celloger^® MiniPlus來創(chuàng)建轉基因斑馬魚的Z-stacking圖像。由于3D幼魚的每個部分可接受的焦平面不同，我們通過操縱自動移動的Z軸來驗證合適的焦平面。我們在多個焦平面中識別出了上焦平面(Z=4.585)和下焦平面(Z=4.685)，并將中間對應的坐標(Z=4.635)設置為掃描位置；并且以掃描位置為中心，在位置的上方和下方各設置以10µm間隔拍攝5張照片(圖5)。

圖5 斑馬魚幼魚拍攝過程

    圖6顯示了斑馬魚的上、中、下焦平面拍攝的照片。側視圖下焦平面頭部形狀清晰，上焦平面腹側部清晰可見。

圖6 斑馬魚拍攝結果

步驟2，Z-projection

    多層成像(Z-stacking)是觀測三維模型的必要手段。然而，解釋多層成像獲得的多幅圖像的結果是費力和耗時的。Z-projection函數(shù)將多個圖層合并為一幅圖像，使一個3D樣本可以作為一幅圖像被清晰完整地觀察到，增加了研究人員的洞察力。

    Z-projection類型是對位于每個X-Y位置的多個Z坐標進行積分的方法。“Maximum”用于整合幾個Z坐標點中最亮的像素，而“Average”用于計算幾個Z坐標點的平均亮度(圖7)。此外，在Celloger^®分析軟件中添加了可以增強的元素“add deviation value”，以獲得更清晰的圖像。

圖7 Z-projection類型 

    在Celloger^®分析軟件中打開Z-stacking拍攝的圖像，點擊Z-stack選項卡上的“merge”按鈕，可以得到Z-projection圖像(圖8)。不同的樣本對應的Z-projection類型不同，建議對每種類型進行確認。

圖8 Z-projection過程 

    圖9顯示了通過選擇“maximum”類型和“add deviation value”選項拼接三幅圖像進行投影的結果。在底部焦平面上清晰地表達了頭部結構，在頂部焦平面上可以觀察到的獨特的腹側形狀，使用投影函數(shù)將其表達為單個圖像。

圖9 結果圖

    我們使用Celloger^® Mini Plus系統(tǒng)成功獲得了斑馬魚的高質量熒光圖像。將三維結構的多層信息成功地組合并清晰地表達在一張圖像中。該實驗證實了使用各種其他樣品類型捕獲3D圖像的可行性，包括球體和類器官，這可以擴大研究人員可用的研究范圍。
 

結語：

    斑馬魚作為一種廣泛使用的動物模型，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、藥物篩選和表觀遺傳學等研究模型，具有完全表征的基因組，并且與人類表現(xiàn)出高度的遺傳同源性。作為一種易于遺傳改造及使用的模型，大量的細胞熒光報告基因和尖端成像技術更加推進了斑馬魚在模型方面的潛力。Celloger^®活細胞成像設備無需反復拿取細胞樣本，在培養(yǎng)箱內(nèi)即可實現(xiàn)對細胞的可視化以及進行長期動力學測定。利用延時成像技術及Z-stacking功能，獲得更清晰的3D熒光成像效果。隨著系統(tǒng)研究的推進和斑馬魚成像效果的提升，這種模式生物可能會繼續(xù)在多種研究領域發(fā)揮關鍵作用。

參考文獻：

[1] Rosa JGS, Lima C, Lopes-Ferreira M. Zebrafish Larvae Behavior Models as a Tool for Drug Screenings and Pre-Clinical Trials: A Review. Int J Mol Sci. 2022 Jun 14;23(12):6647. 

[2] Chia K, Klingseisen A, Sieger D, Priller J. Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease. Front Mol Neurosci. 2022 Oct 13;15:940484.