1、培養基成分的影響
在抗菌藥物敏感性試驗中，培養基的質量十分關鍵。培養基中的游離電解質會影響少數抗菌藥物的敏感性。因此，需對Mueller Hinton瓊脂培養基的成分進行監測，確保Ca⁺⁺、Mg⁺⁺等二價陽離子的含量在可接受范圍內。Ca⁺⁺和Mg⁺⁺含量過高會導致氨基糖苷類和四環素類藥物活性降低，Ca⁺⁺和Mg⁺⁺含量過低則會使其活性增強。
如果Mueller Hinton瓊脂培養基中含有過量的胸腺嘧啶或胸苷，則會抵消某些抗菌藥物的作用，如磺胺類藥物、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲惡唑等，從而形成較小的或者不太清晰的抑菌圈，甚至不會形成抑菌圈，進而導致假耐藥結果。如果磺胺類藥物、甲氧芐啶、甲氧芐啶-磺胺甲惡唑對糞腸球菌ATCC 29212的抑菌圈直徑≤20 mm，則可以判定培養基中含有高濃度的胸腺嘧啶或胸苷。Mueller Hinton瓊脂培養基中的胸腺嘧啶和胸苷含量較低，因此可用于研究抗菌藥物的敏感性。
2、培養基的pH值
在紙片擴散法中，制備的培養基的pH值是一項重要參數。根據美國臨床和實驗室標準協會 (CLSI) 的規定，制備的培養基的pH值應在可接受的范圍內，即7.2至7.4之間。如果pH值超出規定的參數范圍，則抑菌圈大小將發生變化，變化程度取決于抗菌藥物的類別。
例如，pH過高將導致青霉素類和四環素類藥物抑菌圈縮小，喹諾酮類、大環內酯類和氨基糖苷類藥物抑菌圈增大；反之，pH過低會導致青霉素類和四環素類藥物抑菌圈增大，喹諾酮類、大環內酯類和氨基糖苷類藥物抑菌圈縮小；作為常規質量控制的一環，每個制備批次的培養基均應測定pH值。
3、培養皿中瓊脂培養基的厚度
對于抗菌活性，受試菌株的生長速率會影響抗菌藥物的擴散速率。因此，建議在標準工作臺上傾注平板，以達到4至5 mm的厚度（通常對于150 mm培養皿使用70 mL培養基，對于100 mm培養皿使用25至30 mL培養基，對于90 mm培養皿使用20至25 mL培養基）。培養基厚度的變化會影響抑菌圈的大小，從而產生假陽性或假陰性結果。
例如，如果瓊脂層太薄，抗菌藥物會擴散得比應有的更遠，從而產生更大的抑菌圈。如果瓊脂層太厚，抗菌藥物的擴散受到限制，則會產生較小的抑菌圈。
4、接種量
藥敏試驗中，接種量也是最重要的可變因素之一，其對測得的抑菌圈大小有重大影響。當接種量達到臨界量時，才可以測定抑菌圈的邊緣。如果接種量較大，則達到臨界量的時間會較短，并且抑菌圈較小。如果接種量較小，則需要更長的時間才能達到臨界量，抗菌藥物會進一步擴散而產生更大的抑菌圈。建議使用一種能夠產生含適量微生物（即10⁵~10⁶個細胞/mL）的均勻菌懸液制備技術。若接種不當，即使調整了菌液濃度，也可能產生假性結果。接種時應注意正確、均勻地涂布平板以及正確地放置紙片。
5、孵育
恰當的孵育時間和孵育溫度對于藥敏試驗結果的準確性也非常重要。在35℃以上的溫度下孵育可能無法檢測出耐甲氧西林葡萄球菌。在低于35℃的溫度下孵育時，大多數細菌的生長速度變緩；此外，抗菌藥物的擴散速度也更慢。環境中CO₂增加會導致pH值降低，從而影響某些抗菌藥物的活性。因此，除非受試菌株生長需要CO₂，否則平板應在自然空氣中進行培養。因此，在各個階段都必須對儀器進行校準。
6、紙片的儲存
藥敏紙片的存儲必須遵從生產商的說明，即密封儲存在-20℃至+8℃干燥環境中。暫不使用的藥敏紙片不要將包裝筒開封，并應存放在原包裝中，以防受潮。這非常重要，因為眾所周知，水分是抗菌藥物降解的主要原因。在不使用時，必須將已開封盛有紙片的包裝筒冷藏并密封在紙片分配器或其他合適的容器中。包裝筒開封后，紙片存放時間應不超過一周；含有β-內酰胺酶抑制劑（例如克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦）的包裝筒特別容易受潮，這可能會導致抗菌藥物降解。

總結：對于初次接觸藥敏試驗的老師來說，在做實驗之前一定要全面考慮到各種影響因素，在實驗過程中做到及時避免，這樣做出來的實驗才能達到一個理想狀態。如果實驗效果不理想，要分析原因，影響因素有很多，并不一定是藥敏紙片出現的問題。河南海美迪生物技術有限公司以上總結出來的因素，希望對實驗老師有所幫助。